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Peter Parker (Tobey Maguire) é um jovem estudioso que vive com seus tios, Ben (Cliff Robertson) e May (Rosemary Harris), desde que seus pais faleceram. Inteligente e com um grande interesse pela ciência, Peter tem dificuldade em se relacionar com seus colegas, por ser tímido e por eles o considerarem um nerd. Até que, em uma demonstração científica, um acidente inesperado faz com que aranha modificada geneticamente pique Peter. A partir de então seu corpo é quimicamente alterado pela picada da aranha, fazendo com que Peter possa escalar paredes e tetos, emitir pelos punhos um fluido ultra-resistente semelhante à uma teia de aranha e passe a ter um "sentido de aranha", que o avisa sempre que há perigo por perto, além de superforça e visão ampliada. Inicialmente Peter pensa em usar seus novos poderes para ganhar dinheiro, adotando o nome de Homem-Aranha e se apresentando em lutas de exibição. Porém, ao permitir que um ladrão fuja por não considerar sua função capturá-lo, o fugitivo acaba assassinando seu tio Ben. A partir de então, Peter decide não mais usar seus poderes para proveito próprio e sim para enfrentar o mal, tendo como seu primeiro grande desafio enfrentar o psicótico Duende Verde (Willem Dafoe), que na verdade é o empresário Norman Osborn após ter sido exposto à um gás experimental que lhe deu uma segunda personalidade e grande força física.