萬曆二十九年（1601）年初抵達北京，到萬曆三十八年（1610）5月3日在北京病逝，在北京居留九年半。在這九年多期間，利瑪竇一行人一方面結交北京的大臣、官員、士大夫，藉着他們的科技知識，以及對中國儒家學說的尊重，取得中國士大夫的信任。另一方面，致力於傳播天主教。利瑪竇在傳教時，尊重中國文化傳統，不禁止信徒祭祀祖先，容許奉教的讀書人到孔廟祭祀孔子，消除信徒的顧慮，同時，在翻譯天主教經文時，採用儒家經典的語句，使中國信徒感到親切。利瑪竇在北京的時期，正值明朝政局波濤暗湧：萬曆皇帝的皇后王氏無子，而宮女另一王氏誕下庶長子，但皇帝寵愛鄭貴妃，希望立鄭氏所生的庶三子為太子（庶二子早夭），但朝中不少重臣及士大夫、儒生堅持皇帝必須依照儒家「有嫡立嫡，無嫡立長」的禮制，立長子為太子，歷史上稱為「爭國本」。支持立長子的大臣、儒生聚結成「東林黨」，與萬曆帝展開持續十多年的激烈抗爭；一些支持萬曆帝立愛子的大臣，結為「非東林黨」，與東林黨人水火不容。利瑪竇作為外國人，雖然感情上與東林黨人接近，但與大臣交往時，小心翼翼，避免捲入政治鬥爭漩渦。萬曆三十二年（1604）四月，利瑪竇在南京結識的儒生徐光啟高中進士，開始在北京任官，從此不斷利用閒暇時間協助利瑪竇撰寫中文譯著，為《天主實義》、《交友論》在北京再版，又翻譯古希臘數學家歐幾里得（Euclid）的《幾何原本》。利瑪竇把他與十位中國士大夫交往時，討論宗教哲學和人生觀問題的問答，記錄成書，稱為《畸人十篇》，手稿被士大夫所傳抄。該書與《天主實義》是姐妹篇。十位士大夫是李戴、馮琦、徐光啟、曹于汴、李之藻、吳中明、龔錫爵、郭敦華及其他二人。明萬曆三十四年（1606），萬曆帝批准利瑪竇在北京城南宣武門內建屋居住，這地方後來成為天主教傳教士在北京城的重要據點，至今仍然存在，稱為宣武門天主堂，但現有建築物已經過清朝多次重修，非利瑪竇時代的面貌。明萬曆三十三年（1605），瑪竇在北京遇到一位從河南省開封城上京赴考的士子，姓艾名田，他告訴利瑪竇開封城內有一群信奉「挑筋教」的人，其經典內容與天主教《舊約》相同。這群人的祖先來自西域，在宋朝已經定居開封，最初稱為「一賜樂業」。利瑪竇派人到開封探訪，開啟了探索猶太人在中國的歷史。萬曆三十六年（1608）8月，利瑪竇被明神宗傳召入宮，呈獻六軸十二幅《坤輿全圖》，並命隨時可進宮調校時鐘。因此得到皇帝信任。1609年（明萬曆三十七年）2月15日，利瑪竇向耶穌總會彙報來華傳教團情況，指出在華傳教滿懷希望的八個原因。主要提到：學 問備受尊重，儒教雖不關心超自然的事，但倫理觀點“完全與我們一致”，同時，利瑪審還指出，要爭取明朝皇帝恩准天主教大規模在中國傳播根本是不可能的。8月22日，利瑪竇在致歐洲的信中談到中國皇帝命其獻十二幅綢印《坤輿萬國全圖》。9月，利瑪竇開始編寫逐年大事記（即利瑪竇中國劄記），其中有中國各耶穌會居留地的彙報和他自己的筆記。是年獲准在太監和官員陪同下到城牆上行走。1610年（明萬曆三十八年） 5月11日利瑪竇因病在北京逝世，終年五十八歲，萬曆帝御准下葬於北京阜成門外二里溝墓地。至是年，中國內地天主教徒已發展至二千五百人，其中包括徐光啟、李之藻、楊廷筠等有學問的明朝高級官員。利瑪竇去世之後，耶穌會任命龍華民神父（Nicholas Longobardi，1559-1655）繼任駐華傳教團教長。龍華民一反利瑪竇尊儒傳教的正確路向，認為「祭祖尊孔」違背背天主教義，天主教徒不應參加。此舉引致明朝大臣接連向萬曆帝上書，主張禁止天主教在中國傳播，使傳教處於困境。

萬曆二十八年（1600年）利瑪竇在南京獲得吏科給事中祝世祿的幫助，以朝貢的名義，獲得批准往北京的證件。5月18日，利瑪竇偕龐迪我神父和鍾鳴仁、游文輝兩修士及四名僕人，乘搭駐守南京的劉太監官船，啟程前往北京，郭居靜神父留在南京。利瑪竇一行人沿大運河北上，路過山東濟寧時，拜會了曾在肇慶任職的漕河總督劉東星，並再次遇到劉總督的朋友著名學者李贄。利瑪竇在南京時曾與李贄會面，李贄對利瑪竇學識淵博十分敬佩，稱讚他的品格勝過大多中國士人，他在湖廣講學時，向學生推崇利瑪竇的《交友論》；而利瑪竇稱讚李贄「極標準人也，中極玲瓏，外極樸實」。李贄是福建泉州人，別號卓吾。他公開以「異端」自居，經常發表公然挑戰傳統儒家士大夫價值觀和禮俗秩序之言論，認為當時官方所尊崇的儒家程朱理學（宋朝學者程頤、朱熹所提出的重視綱常禮教學說）是僞道學，稱道學先生為「鄙儒」、「俗儒」、「腐儒」，斥其「陽為道學，陰為富貴」。他認為表面尊崇儒學官吏，其所作所為是「不操戈矛之強盜」「吃人之老虎」。李贄主張男女自由婚姻，稱讚卓文君、紅拂女等女子之善於擇配，但又讚揚某些遵守傳統「婦德」的行為。他又主張創作必須抒發己見，從「絕假純真」之「童心」出發，反對「以多讀書，識義理障其童心」。重視小說戲曲在文學上的地位，認為《西廂記》《水滸傳》就是「古今至文」。曾評點多《水滸傳》《西廂記》等。李贄的「狂放」，在不少當權的士大夫、大臣心目中，是「敢倡亂道、惑世誣民」，加以斥逐。李贄與利瑪竇在濟寧會面之後，應朋友的邀請入京，卻被錦衣衛緝捕，投入獄中，並銷毀其著作。萬曆三十年（1602年），李贄以剃刀自刎死去。離開濟寧之後，利瑪竇一行到達天津，在天津逗留了三個月。天津官員檢查利瑪竇行李時，發現耶穌死難十字架，認為利瑪竇等人「行蠱」，欲加害皇帝，把利瑪質等投入監獄。幾經周折，萬曆皇帝得知利瑪竇等人要呈獻他一座自鳴鐘，便准許他們進京。萬曆二十九年（1601年）1月24日利瑪竇一行終於抵達北京，向皇帝呈獻自鳴鐘、西洋琴、《萬國圖志》等禮物，這年利瑪竇是49歲。然而，北京禮部只許利瑪竇等人居住在四夷館，並且認為外國國人不宜久居京城，要求皇帝驅逐離京。但奏疏留中，幾個月後，皇帝通過大太監傳話，不僅允許神父們留下，還每月發八個金幣的補貼給神父們。原因是需要神父們維修自鳴鐘。5月28日，神父們得以遷出四夷館，租貨民房居住。自此之後，利瑪竇結識了不少朝廷大臣，例如戶部尚書、武英殿大學士沈一貫，吏部左待郎兼翰林院侍讀學士馮琦，吏部尚書李戴，刑部尚書蕭大亨，光祿寺少卿李之藻等，其中李之藻成為利瑪竇重要信徒之一。據稱，李之藻開始師從利瑪竇學習西方科學。但不願信奉天主教，其後李之藻在北京突患重病，李以為必死，留下遺囑，利瑪竇「朝夕於床笫間，躬為調護」，於是皈依天主教，聖名良（Leo），將家中供祀的佛像毀棄，換上耶穌像，奉行一夫一妻，決心休離侍妾，正式受洗，與徐光啟、楊廷筠並列為「中國三大天主教柱石」之一。

利瑪竇在萬曆十七年（1589年）夏天定居韶州（今廣東省韶關市），至萬曆二十三年（1595年）春末離開，前往江西南昌，一共在韶州居留五年多。期間他改穿儒生服裝，以儒士自居，多次往來韶州、肇慶、澳門之間，結交不少路過的儒生士大夫，傳教事業有所進展。但在這數年內，他的助手麥安東修士，及石方西神父先後去世，萬曆二十二年七月，耶穌會派遣郭居靜神父（Lazzaro Cattaneo，1560—1640年）到韶州協助利瑪竇。郭居靜神父後來到上海、杭州傳播天主教，1640年在杭州逝世。萬曆二十三年四月，兵部侍郎（可能是浙江人孫鑛）之子因科舉應試失敗得了精神抑鬱症，派人到韶州邀請利瑪竇到南京治病。於是利瑪竇帶領兩個年輕的中國教友由韶州出發，北上前往南京。據利瑪竇記述，侍郎常邀他到自己的座駕大船，聽他講歐洲各地的情形。到達南京之後，適逢日本侵略朝鮮戰爭（又稱「壬辰倭亂」）展開，明朝出兵為朝鮮抗倭，氣氛十分緊張，南京官府不願接待外國人，於是利瑪竇轉往江西南昌，直至萬曆二十六年（1598年）中，新任南京禮部尚書王弘誨從海南島上京途中經過韶州，郭居靜神父拜訪了他，王弘誨不僅答應帶神父們上南京，還說該年農曆八月十七日（西曆9月17日）是皇帝誕辰，可與神父一起上北京，向皇帝貢獻禮品。利瑪竇一行人從南京沿大運河北上，到達北京，但因為朝鮮戰爭仍然持續，不許外國人入京，必須折返南京。利瑪竇等人得到王弘誨庇護，獲准在南京居留。萬曆二十七年2月6日，利瑪實抵南京城，寄寓承恩寺。同年農曆四月，朝鮮抗倭戰事取得全面勝利。在南京，神父們的名聲大噪，達官貴人競相邀請。當中有南京刑部尚書趙參魯、南京戶部尚書張孟男、南京都察院右都御史王樵、南京禮部右侍郎葉向高、國子監祭酒郭正域（號明龍）、國子監司業楊道賓（號荊岩）、吏科給事中祝祿、江寧分守道吳中明、都察院左都御史王汝訓、太僕寺少卿李本固、南京工部員外郎劉冠南，以及魏國公徐弘基（明初開國功臣徐達後裔），曾任京城太監總管被貶南京安置的馮保，曾在翰林院編修任上被迫辭職 回南京家居的萬曆十七年狀元焦竑等等，紛紛與利瑪竇交往。而以「狂放」聞名的狂士李贄，亦多次登門拜訪，李贄對利瑪竇的《交友論》大加讚賞。另一位利瑪竇在南京結識的士大夫，是上海縣人徐光啟（1562—1633年），他在南京會晤利瑪竇，兩人一見如故。萬曆二十一年，當時仍然是秀才的徐光啟，在韶州任教，結識了郭居靜神父，萬曆二十八年（1600年），已經成為舉人的徐光啟赴南京拜見恩師焦竑，並首次與利瑪竇會面，他對利瑪竇的學識和品德十分仰慕，決心追隨利瑪竇學習天主教義及西方科技，並於萬曆三十一年（1603年），在南京由耶穌會士羅如望（Jean de Rocha）受洗成為天主教徒，聖名為保祿（Paulus）。徐光啟是中國士大夫信奉天主教第一人。他在崇禎年間曾任殿閣大學士。

利瑪竇在肇慶的時候，認識了一些北上南下的士大夫（讀書人），其中一位是著名的戲曲作家湯顯祖。湯顯祖（明嘉靖二十九年至萬曆四十四年，即1550-1616年），江西臨川人（今江西省撫州市臨川區），出生於士大夫之家，從小便飽讀詩書，性格剛正不阿。二十出頭便考中舉人，進京赴考，卻因不願意阿附當時權勢顯赫的首輔張居正，結果兩次落第。直至萬曆十一年（1583年）即張居正死後次年，他考中三甲二百十一名進士。當時是三十三歲。湯顯祖中了進士後，仍不肯趨附新任首輔申時行，被安排在南京任無實權職位，在職期間，與「東林黨人」顧憲成、高攀龍等人交往甚密。東林黨是一群不滿當時權臣當道，朝政敗壞的士大夫，在無錫東林書院講學，藉「爭國本」（即反對廢長立幼，阻止萬曆帝準備立愛妃鄭氏所生庶三子，支持立萬曆帝庶長子為皇太子，君臣爭持十多年）抨擊朝政，形成龐大民間輿論。萬曆十九年（1591年）湯顯祖呈上《論輔臣科臣疏》，揭發時政積弊，彈劾執政大臣，因而觸怒了皇帝，被貶謫為廣東徐聞縣典史（徐聞縣在雷州半島南端，典史是縣級官吏中最低級，屬九品之外的「未入流」品級，掌管緝捕、稽查獄囚等職務）。他南下赴任時途經澳門，目覩葡萄牙人商埠的異國風俗，得知有來自萬里海外的「番僧」，深感興。其後，湯顯祖調任浙江遂昌知縣，北上路過肇慶，得以拜訪利瑪竇，與利瑪竇談論天主教義理及佛法，利瑪竇不諱言「破佛立義」的觀點，而湯顯祖也坦白地將利氏的觀點在詩作「端州逢西域兩生破佛立義」及「偶成」兩首詩中：其一畫屏天主絳紗籠，碧眼愁胡譯字通。正似瑞龍看甲錯，香膏原在木心中。其二二子西來跡已奇，黃金作使更何疑？自言天竺原無佛，說與蓮花教主知。詩中的「二子」就是利瑪竇和他的助手。而湯顯祖詩所提及的「天主」，正是利瑪竇對宙斯神的中文譯名。湯顯祖在地方為官清廉，體恤民情，深得民心，但最終還是因不滿朝政腐敗，於萬曆二十六年（1598年）棄官回鄉，在臨川建屋閒居，號「玉茗堂」，從此致力於戲劇和文學創作，終其一生。湯顯祖一生共創作完整的戲劇作品四種：《紫釵記》、《牡丹亭》、《南柯記》和《邯鄲記》。因劇中都有夢境的描寫，湯顯祖又是江西臨川人，故四劇合稱「臨川四夢」，作者晚年居所號「玉茗堂」，又稱「玉茗堂四夢」。湯顯祖詩、文、賦著述亦豐富，有《紅泉逸草》、《問棘郵草》、《玉茗堂全集》等刊本流傳。他的戲曲創作打破前人範式，反對擬古和拘泥于格律，特別着重劇中人物的深情。他在劇中訴說：「情不知所起，一往而深，生者可以死，死可以生。生而不可與死，死而不可復生者，皆非情之至也。」「嗟夫！人世之事，非人世所可盡。自非通人，恆以理相格耳！第云理之所必無，安知情之所必有邪！」「人生而有情，思歡怒愁，感於幽微，流乎嘯歌，形諸動搖，或一往而盡，或積日而不能自休，蓋自鳳凰鳥獸以至巴渝夷鬼，無不能舞能歌，以靈機自相轉活，而況吾人？」他更把在澳門所見所聞，寫在戲曲之中，例如在《牡丹亭》第二十一齣（幕）《謁遇》寫主人翁到了澳門，【光光乍】(老旦份僧上)一領破袈裟，香山㠗裏巴。多生多寶多菩薩，多多照證光光乍。小僧廣州府香山多寶寺一箇主持。這寺原是番鬼們建造，以便迎接收寶官員。茲有欽差苗爺任滿，祭寶於多寶菩薩位前，不免迎接。【前腔】(老旦)大海寶藏多，船舫遇風波。商人持重寶，險路怕經過。剎那，念彼觀音脫。(合前)【前腔】天地精華，偏出在番回到帝子家。稟問老大人，這寶來路多遠？(淨)有遠三萬里的，至少也有一萬多程。(生)這般遠，可是飛來、走來？(淨笑介)那有飛走而至之理。都因朝廷重價購求，自來貢獻。(生歎介)老大人，這寶物蠢爾無知，三萬里之外，尚然無足而至；生員柳夢梅，滿胸奇異，到長安三千里之近，倒無一人購取，有腳不能飛！他重價高懸下，那市舶能姦詐，嗏，浪把寶船撶。第二十二齣（幕）《旅寄》寫柳夢梅從澳門北上，經韶州、梅嶺到江西南安府，生病，吟詩云：「香山㠗裏打包來，三水船兒到岸開。要寄鄉心值寒歲，嶺南南上半枝梅。」我柳夢梅。秋風拜別中郎，因循親友辭餞。離船過嶺，早是暮冬。不隄防嶺北風嚴，感了寒疾，又無掃興而回之理。一天風雪，望見南安。好苦也！湯顯祖早年曾從泰州學派羅汝芳讀書（泰州學派源於王艮，他於嘉靖初年在泰州講學，主張「百姓日用即道」，學生多是社會基層人士，如農夫、樵夫、陶匠、灶丁等，強調「滿街都是聖人」，「人人君子」，「堯舜與途人一，聖人與凡人一」，「聖人不曾高，眾人不曾低」，「庶人非下，侯王非高」。雖被斥為異端，卻道出小市民的心聲）。其後又受反傳統的「奇士」李贄的思想影響，他讚賞李贄的學說，不拘泥於傳統，敢於表達個人直覺，讚賞「童心」，作品是「不思而至」的自然表現。湯顯祖認為「奇士」的作品自然出類拔萃。他對利瑪竇的新奇器物及思想深感興趣，與晚明思想新潮流關係密切。

羅明堅試圖在中國打開急進式傳教局面遭到的失敗，不得不離開肇慶，甚至離開中國，回到羅馬。利瑪竇代替羅明堅，主持肇慶僊花寺的教務，他貫徹范禮安神父開創的溫和路線，擺脫了急進式擴大傳教步伐，採取適合中國國情的緩緩進取路向。利瑪竇的博學和僊花寺豐富的西方文化藏品吸引了眾多廣東高官和士人前來拜訪。在當時得到朝廷認可的新興起「王學」思潮（即王陽明在正德、嘉靖年間開創的「心即理」「致良知」學說，重視探尋新知識，建立個人觀點）影響下，中國新一代士大夫對新知識興趣濃厚。在肇慶，利瑪竇結識了時任廣東參議的徐大任、潮州知府的郭子章、廣東右布政使滕伯輪、廣西全州士人蔣之秀、廣東清遠士人鍾萬祿。他們都成為利瑪竇的好朋友。但好景不常，王泮升官離開廣東之後，新任總督劉繼文信奉道教，深信占卜和扶乩、風水命理，認為僊花寺佔得風水寶地，妨礙他的官運，於是聲稱來自澳門的幾個傳教士是葡萄牙人的「奸細」，把打聽到的有關中國的一切事情都通報給葡萄牙人，並且經常耍花招勾引無知百姓，下令把所有神父遣返澳門，或者驅逐往廣東北部的韶關看管。總之，不許神父繼續留在肇慶。1589年（明萬曆十七年）初，利瑪竇準備離開肇慶時，卻結識了總督劉繼文的同鄉好友瞿太素，他與利瑪竇一見如故，向利瑪竇學習西洋科技。瞿太素，名汝夔（音葵）其父瞿景淳，南直隸常熟人，嘉靖間會試第一（會元），殿試第二（榜眼），官至禮部左侍郎，兼翰林院學士。其長兄瞿汝稷，官至太僕寺少卿，是著名的佛教學者，致仕後，撮輯歷代神僧法語為《指月錄》，盛行於世。二兄瞿汝說，官至湖廣提學使，著有《皇明臣略》百卷。太素年輕時是著名的「不羈浪子」，因與長兄之妻徐氏通姦被逐出家門，浪跡各省，在衙門中為幕僚（俗稱「打秋風」或「乞食侯門」）。結識利瑪竇之後，跟利瑪竇學習《同文算法》、《渾蓋圖說》、《歐幾里得幾何》，並將《歐幾里得幾何》第一卷譯成中文，並皈依天主教。成為利瑪竇的忠實朋友。瞿太素向總督求情，延遲了驅逐神父的計劃。其後，劉繼文同意遣送利瑪竇到韶州居留，韶州即今韶關市。劉繼文吩咐通判（官職）呂良佐陪同利瑪竇到韶州，8月中，利瑪竇乘船離開居留六年的肇慶北上，先寄居在韶州最大佛寺南華寺。當時他已三十七歲。利瑪竇經此挫折，借佛教的名號在中國傳播天主教福音，並非良策。他在肇慶六年與官員、民眾交往的經歷，使他逐步認清了中國傳統的主流信仰是儒學：它不是西方意義上的宗教（利瑪竇稱之為自然神學），中國人靠儒學協調信教與不信教的矛盾，以及儒、佛、道等各種不同的信仰和文化之間的關係，達致「和而不同」的理想境界。利瑪竇在肇慶遭遇不少困難，引起不少誤解和碰撞，都是靠郭應聘、王泮、朱東光、蔡夢說、黃時雨、方應時等一些具有較深儒學素養的官員和文人士大夫的幫助，才得以一次又一次化解危機，走出困境。促使他逐步走上尊重儒學之路，他吸收孟三德、羅明堅等神父急進式傳教的失敗教訓，放棄用西方宗教來「歸化」，中國人的企圖，把宗教傳播變為以科技文化為先導，慢慢深入到哲學層面溝通的文化活動，尊重中國國情，與中國社會相適應的正確路向。萬曆十七年8月24日，利瑪竇抵達韶州南華寺，向寺中和尚表明天主教與佛教有別，拒絕在寺中居留，被送到韶州府城，暫居武水西岸光孝寺，其後得到總督批准，並獲得范禮安撥款，利瑪竇在韶州光孝寺附近建築中式居所和教堂。其後，范禮安從澳門派鍾鳴仁與黃明沙兩位華人天主教徒到韶州協助利瑪竇，並從印度果亞召來蘇如漢、羅如望兩神父，要他們到澳門準備入中國內地傳教。瞿太素到了韶州，師從利瑪竇，打算學習煉金術，但利瑪竇只教他歐洲的天文學和數學。太素認真學習了利瑪竇老師丁公的《天球論》和歐幾里得的《幾何原本》，並用圖表裝點他的學習手稿，用木材和金屬製造各種科學儀器，如六分儀、天球儀、象限儀、日晷、量角器等。瞿太素成了把西方科技文明引進中國最早的引介人。

萬曆十二年（1584年）春天，利瑪竇、羅明堅等西方傳教士，獲得兩廣總督及肇慶知府的批准，在新落成的教堂「僊花寺」居住，開始在肇慶傳播天主教福音。夏天，利瑪竇聘請了福建秀才司賓住到教堂，當他的中文教師。他把羅明堅在澳門時翻譯成漢文 的神學教科書《聖教實錄》重新修訂，補充和重編，採用明代講學盛行的語錄體，由中士發問，西士作答，改名《天主實錄》。在翻譯過程中，利瑪竇對拉丁文《聖經》中，Deus一詞，反覆斟酌，力求詞義準確，並且不抵觸明朝政治忌諱，敲定用「天主」一詞，一直沿用至今。其後，利瑪竇又將十大天主教誡條翻譯成中文，即《天主十誡》，印發宣傳單張分派給進來教堂參觀的人。又翻譯《天主經》《聖母經》等經文，供信徒吟誦。《天主十誡》的譯文如下：一、欽崇一天主在萬有之上 (敬拜獨一的上帝)二、毋呼天主聖名以發虛誓 (不可妄稱上帝的名)三、守瞻禮主日 (守安息日為聖日)四、孝敬父母五、毋殺人六、毋行邪淫七、毋偷盜八、毋妄證 (不可作假見證)九、毋願他人妻十、毋貪他人財物同一時期，利瑪竇在教堂內忙於製造自鳴鐘，從澳門聘請來自印度果亞的製鐘匠協助製作，萬曆十二年9月，中國第一座自鳴鐘製成。肇慶知府王泮已經升遷為嶺西道道台，經常到僊花寺探望利瑪竇，王泮看到了掛在圖書室內內的奧特里烏斯（Abraham Ortelius，1527-1598）繪製的拉丁文世界地圖，很感興趣。於是請利瑪竇為他繪製一幅中文世界地圖。利瑪竇把圖繪出後，王泮和同僚們看到這幅地圖把中國放到地球最東的邊緣上，便感到不大滿意。他們 說，既然地為圓球，而球體的本性就是無頭無尾的，站在西方的位置上看周邊世界，自然以西方為中心，但站在大明帝國的位置上看周邊世界，就應該以大明帝國為中心。利瑪竇從善如流，按照王泮的意見，並參照嘉靖年間江西狀元羅洪先繪畫的明朝分省及世界地圖集《廣輿圖》修訂，繪成了《山海輿地圖》，由王泮出資刻版印刷了十多張，把它當作珍貴禮物送給當地要人和好友。利瑪竇把新繪製的《山海輿地圖》寄回羅馬耶穌總會保存。利瑪竇與羅明堅為了表示歸化中國，按照中國人的習慣，各為自己取了別號，利瑪竇自稱「西泰子」，而羅明堅別號則為「復初」。羅明堅經常往來於肇慶及澳門，為教堂籌募經費。又曾經以探望王泮父親為名，到浙江、江西旅行，順便傳教。萬曆十四年他聽聞湖廣的武當山香火甚盛，希望前往武當山，他途經廣西桂林時，想叩見受封於桂林的靖江王，卻被桂林的官員阻撓，把他驅逐回肇慶。年底，王泮在兩廣官場壓力之下，對羅明堅神父等人一再違反社情民意，擅自推行急進式傳教，頒令神父們馬上回到澳門。後來經利瑪竇申訴，允許留下一兩人，而其他神父必須離開肇慶，於是幾經商議，決定先讓推動此次急進式傳教的教團監督孟三德神父返回澳門去。不久，羅明堅返回羅馬晉見教皇，順便攜帶他與利瑪竇完成翻譯的《四書》第一篇《大學》的拉丁文譯本帶回羅馬。並計劃請求教皇派遣使節覲見中國皇帝，要求批准在中國傳教，但不得要領。羅明堅離開肇慶就再沒回來。其後羅明堅在羅馬去世（1607年，即明萬曆三十五年）。

1578年（明萬曆六年） 3月29日，利瑪竇與孟三德、羅明堅等耶穌會士一行十四人，得到葡萄牙國王的贊助，離開里斯本，分乘三艘葡萄牙商船前往東方。目標是繼承方濟各沙勿略的遺志，往中國傳播福音，拓展天主教的影響力。同年9月13日，利瑪竇、羅明堅、巴范濟和阿卡維伐等人到達印度果阿。此後，利瑪竇在果阿聖保祿學院居，住了四年，繼續攻讀神學，同時教授拉丁文和希臘文，並且在果阿一帶傳教，有明顯的成果，期間進升為司鐸（神父）。羅明堅則在到達果阿之後，動身前往澳門。當時負責耶穌會東方教區的總視察員范禮安（Alessandro Valignano ，1539-1606），在澳門去信給耶穌總會會長，說他經過九個月的觀察和詢問，認為「中華民族是一個聰明的、有成就的、獻身於藝術研究的民族。這個民族是可以被說服允許一些同樣以學識和品德出名的外國人來到他 們中間居住的，假如他們的客人精通中國語言文字的話，這個民族有一天會樂於接受基督教」，因此范禮安要求耶穌會至少選派一位適宜學習中國語言文字並準備到中國傳教的耶穌會士到澳門來。意大利的那不勒斯人羅明堅（MicheleRuggieri，1543-1607）被選送來擔負這項任務。羅明堅在澳門請了一個畫家教他學習中國的語言文字，並學習中國的禮儀。經過兩年多的刻苦攻讀，羅明堅掌握了一萬二十多個中國單字，但他年紀已36歲，說中國話仍感困難。於是，他開始跟隨葡國商人進出廣州，參加這裡舉行的交易會。而且通過贈送鐘表等禮物，結識不少廣東官員，因此被賜予特權，在市集期間安排羅明堅到暹羅使團專用的館邸中住宿，不必像其他外國人一樣回船上過夜。羅明堅在澳門耶穌會修道院（聖保祿公學）旁邊建立聖馬丁備修院，一方面向澳門居民傳教，一方面為新來澳門的耶穌會士提供學習中文的場所。為在廣東傳教奠定基礎。萬曆十年（1582年）范禮安為了加強對華傳教，決定加派傳教士到澳門，於是邀請利瑪竇到澳門協助羅明堅。陽曆8月7日，利瑪竇抵達澳門，先在澳門澳門學習漢語漢字，為進入中國內地傳教作準備，同時參與撰寫范禮安著述的《聖方濟各•沙勿略傳》的第三章《論中國的奇跡》。12月初，兩廣總督陳瑞致函澳門神父，准許神父到總督駐地肇慶建造教堂和寓所。 於是巴範濟、羅明堅與譯員裴理伯前往肇慶，利瑪竇留在澳門靜候佳音。巴範濟、羅明堅受到兩廣總督陳瑞接見。他們獻上鐘錶和幾隻三稜鏡，總督非常高興，他分派給他們一座寬敞的住所，與城東門外天寧寺相通。在這裡，羅明堅認識了肇慶儒生陳理閣（應為高要縣舉人陳萼，萬曆《肇慶府志》撰修者之一）。但不久，總督陳瑞離任，羅明堅等神父必須離開肇慶，回到澳門。羅明堅通過送禮請托，得到許可，與利瑪竇到廣州見到了海道副使朱東光，向他陳述神父們是慕中華帝國之名，遠涉重洋，想留在這裡度過餘年。他們祇需要有一小塊地方，建築房屋以及一座禮拜天主的教堂。朱東光答應代為呈請兩廣總督，不久，即該年8月，肇慶知府王泮就派使者到澳門遞交一封由新任兩廣總督郭應聘的批准信，邀請神父們到肇慶修建住所和教堂。9月1日，羅明堅、利瑪竇與譯員斐理伯離開澳門。10日抵達肇慶，他們在府署中受到王泮的禮遇。神父們從此穿上僧服，在肇慶定居下來。是年利瑪竇31歲。經過實地觀察，神父們決定在西江岸邊，興建中的崇禧塔附近，建造教堂和住所。經總督批准，知府王泮在崇禧塔之北劃出一角土地給神父，並在利瑪竇要求下把所劃地皮增到一畝多。 教堂施工開始後，負責建塔監工的高要舉人譚諭發現神父們建的不是佛堂而是歐式建築，有違中國寺廟中塔與佛堂同在一條中軸線的建築佈局，提議將教堂建築用地移到塔的東側，使教堂大門能夠獨立開在塔圍牆外的路邊，自為一所。神父們高興地同意了這一方案利瑪竇在儒生陳理閣（陳萼）的幫助下，把從歐洲帶來的三稜鏡賣給一商戶，得二十金錠支持建設費用。為了籌集建築經費，羅明堅和翻譯斐理伯返回澳門，向王泮辭行，羅明堅答應在澳門為王泮訂購一座自鳴鐘。萬曆十二年（1584年）4月，教堂的第一層落成，取名「聖童貞院」，中間大廳佈置聖壇，上掛聖母畫像。大廳兩側四個房間，一為寢室，二為地圖展示室和繪製室，三為西文圖書館和會客室，把神父們從歐洲帶來的一批天文、地理、數學、機械、水利及城市建築畫冊放在裡面展出。四為天文儀器陳列室，並在此製作日晷和自鳴鐘。教堂落成之日，王泮題寫了「僊花寺」（即仙花寺）的牌匾掛在大門上，還題寫了「西來淨土」牌匾掛在會客室兼西文圖書館的牆上。王泮特地在教堂外貼上一張佈告，說明外國僧人入住的房屋是經兩廣總督批准興建的，任何人騷擾他們，要受嚴懲。不久，王泮又給神父們送來兩個文件：一件是房屋用地許可證，另一件是准許他們經廣州來往澳門的通行證。羅明堅、利瑪竇開始在肇慶定居。

明萬曆十年，1582年8月7日，利瑪竇到達當時由葡萄牙人租借的中國南方港口澳門，展開他的中國傳教生涯。向遙遠的東方傳播天主福音，推廣天主教，是耶穌會創辦者羅耀拉、方濟各沙勿略等人的願望，所以1540年耶穌會創立的第二年，即1541年4月，方濟各沙勿略得到葡萄牙國王若昂三世的支持，與卡瑪利諾（M. P. de Camerino）、曼西亞（F. Mansillas）等伙伴，乘搭葡萄牙商船，從里斯本出發，沿着葡萄牙開闢的東方航路，前往東方的印度、中國、日本等地傳教。方濟各沙勿略（Francisco Xavier，1506-1552）出身於西班牙北部巴斯克地區的貴族家族，由於戰亂，家道中落，失去了領地，而且父親早逝，但方濟各仍然努力求學，19歲時到法國巴黎大學聖巴巴拉學院攻讀哲學，取得碩士學位，並留校擔任講師。他在巴黎結識了比他年長十五歲的同鄉依納爵羅耀拉（Ignatius of Loyola，1491-1556），租屋同住，日夕相處，方濟各受到羅耀拉啓發：「人縱然賺得了全世界，卻賠上了自己的靈魂，為他有什麼益處？」（《新約聖經·瑪竇福音·十六:26），萌生改革天主教，弘揚天主福音的使命，1534年與羅耀拉等七人，以「神貧」「貞潔」為宗旨，創立耶穌會。1540年9月27日，教宗保祿三世正式承認耶穌會地位，任命羅耀拉為第一任會長，方濟各成為耶穌會的首批傳教士，並且以耶穌會分支「沙勿略分會」創立人的身份，帶領兩位志同道合的同伴，往遙遠的東方傳教。1542年5月6日，方濟各等人抵達葡萄牙在東方的港口殖民地果阿，在果阿傳教三年多，取得相當成果。1545年8月底，方濟各沙勿略前往馬六甲，他在馬六甲認識了日本商人彌次郎，於是在1549年8月15日（聖母升天節）他攜同兩位耶穌會士（島來斯神父、斐迪南修士）跟隨彌次郎乘船北上，前往彌次郎的家鄉，日本南部的鹿兒島。他成為第一位踏上日本國土的天主教傳教士。方濟各等人的傳教事業效果顯著，年底，鹿兒島已經有一百五十人、附近地區有四百五十人領洗入教。其後擴鹿到九州、中國（日本本州西南部地區廣島一帶稱為「中國」）、近畿（京都、大阪一帶）等地。方濟各希望能面見天皇，要求取得在日本傳教權利，但不成功，而且當時日本正處於戰國時代（1467-1590），各地藩主（日本稱為「大名」）擁兵割據，互相攻伐，傳教困難重重。方濟各得知日本深受中國文化影響，假如中國人改信天主教，必會影響日本，於是決心訪問中國。但當時中國沿海正遭受倭寇的侵擾，海禁嚴厲，外國傳教士要進入中國，非常困難（葡萄牙人獲准在澳門居留，在1557年）。1552年（嘉靖三十一年），他在馬六甲組織了赴中國的葡萄牙使團，希望覲見中國皇帝，但被葡萄牙的馬六甲總督阻止。於是他決心獨自前往中國，1552年8月（嘉靖三十一年七月）底，抵達廣東沿岸的上川島（現在屬於江門市台山區），準備偷渡進入內地，但協助他們偷渡的中國商人失約，遲遲不來。12月3日（嘉靖三十一年十一月十八日）晨，沙勿略染上瘧疾，在島上逝世，年僅46歲。這一年10月6日，利瑪竇出生。次年，1553年（嘉靖三十二年）葡萄牙人獲准在澳門「登岸曬貨」，四年之後，1557年（嘉靖三十六年），葡萄牙人開始獲准在澳門居留。

1577年，即明神宗萬曆五年，利瑪竇獲得耶穌會批准，前赴東方傳教。次年，1578年3月24日，利瑪竇從葡萄牙里斯本啟航，乘塔武裝商船，與另外十四位耶穌會士開始踏上出東方航路。商船沿著非洲西岸南下，然後繞過非洲最南端的好望角，折向北行，到達非洲東岸的葡萄牙殖民地莫桑比克，再向東到達印度半島西南岸的另一個殖民地果亞（Goa），歷時六個月，9月13日在果阿登岸。這條東方航路是九十年前由葡萄牙航海家所開闢。1487年8月，廸亞士（Bartolomeu Dias；1451年—1500年）船長奉葡萄牙國王之命，率領一支由3艘船組成的船隊離開里斯本，前往探尋一條繞過非洲大陸到達印度的貿易航線。1487年12月，船隊到達最後一個歐洲人已知非洲海灣孔塞桑灣（現在納米比亞的鯨灣），向未知的海域繼續航行。經過數日航程，到達一處海角，遇到暴風雨，被風暴吹向南，遠離海岸線。風暴結束後，船隊向東航行，卻無法找到原本南北走向的非洲大陸海岸，於是船隊轉向北航行，1488年2月3日，海岸線再次出現，因此迪亞士確認已繞過非洲大陸南端的全部海岸，但船員不肯前行，返回里斯本向國王報告發現了非洲南端。這個廸亞士遭遇暴風的海角，後來稱為「好望角」。十年之後，另一位葡萄牙航海家瓦斯科·達·伽馬（Vasco da Gama，1469年—1524年）率領船隊，沿着廸亞士所發現的好望角航線，繼續前行，橫過印度洋，1498年在印度半島西南岸的港口果亞（Goa，又譯臥亞，今印度果阿邦），1510年，葡萄牙以武力奪取果亞舊城，將果阿建設成殖民地及海軍基地。果阿亦成為天主教在東方傳教的重要基地。十一年之後，1511年8月24日，葡萄牙駐果亞的印度總督率領艦隊，攻陷馬來半島西岸，控制馬六甲海的戰略重鎮馬六甲城。馬六甲成為葡萄牙向東擴張的戰略基地。馬六甲原本是獨立的邦國，明朝稱為滿刺加，鄭和下西洋時，派使者隨鄭和航隊赴北京朝貢，成為明朝藩屬國。葡萄牙人驅逐馬六甲末代蘇丹（國王），並冒認滿刺加往中國朝貢，希望打通中國貿易。1513年（明正德七年）夏，葡萄牙武裝商船首次抵達廣東沿岸，但被廣東官府拒絕登陸。其後，佔據珠口的外伶仃島，宣稱屬於葡萄牙領地，還在附近的屯門（即香港屯門海口，現已填海）設置了葡萄牙人居留地。正德十六年（1521年）廣東海道副使汪鋐率水師圍攻屯門，驅逐葡萄牙人（茜草灣之戰）。葡萄牙船艦在珠江口一帶尋求新立足點，嘉靖十四年（1535年），葡萄牙人賄賂廣東地方官吏，取得在香山澳（今澳門半島）停靠船舶及進行貿易的權利。嘉靖三十二年（1553年），又貨物被水漬為理由，登岸「借地曬貨」，乘機在岸上建房舍，嘉靖三十六年（1557年）起已在澳門定居。嘉靖三十九年（1560年），居澳葡人已選出地方首領、法官和四名商人代表，形成了管理機構。據稱，葡人除向明朝廣東市舶司繳納船稅外，爲鞏固其在澳門的地位，每年賄賂廣東海道副使五百兩白銀。萬曆十一年（1583年），成立澳門議事會。明朝亦在澳門設置香山縣丞（香山縣即今中山市，縣治在石岐），駐半島北部，管治澳門。嘉靖四十二年（1563年）葡萄牙首次向澳門派出耶穌會傳教士。隆慶二年（1568年）1月23日，耶穌會士賈耐勞（D. Belchior Carneiro Leitão ，1516年—1583年，仁慈堂創辦人）被葡萄牙國王任命為天主教澳門教區第一任主教，澳門成為天主教在遠東的傳播中心。利瑪竇在果阿傳教四年，1580年晉升為神父，1581年（明萬曆九年），在澳門的羅明堅神父（Michele Ruggieri，1543年—1607年）向耶穌會東方總巡察使范禮安（Alessandro Valignano，1539年2月15日—1606）舉薦了利瑪竇。次年（萬曆十年，1582年）利瑪竇應召前往中國，8月7日到達澳門，展開他的中國傳教生涯。

利瑪竇在1552年（明嘉靖三十一年）出生於意大利半島中部東岸的市鎮馬切拉塔（Macerata），當時是羅馬教皇的領地。他的父親是當地藥房的老闆，是虔誠的天主教徒，為人老實，曾擔任市政廳議員。利瑪竇是家中長子，父親對他寄望甚大，邀請學識淵博的賓奇維格尼（Nicolo Bencivegni）神父為小利瑪竇啓蒙老師。利瑪竇9歲時，進入耶穌會開辦的學校，學習人文學科和修辭學，他天資聰穎，記憶力特別強，成積優異，進步神速，在學習期間，已有獻身修道之志。1571年8月15日，利瑪竇19歲時，正式申請加入耶穌會。次年；進入耶穌會所創辦的羅馬公學（Collegio Romano，1515年由依納爵·羅耀拉Ignatius de Loyola 所創辦，其後經由教宗額我略十三世擴充，1873年改制為「宗座額我略大學」Pontificiae Universitatis Gregorianae，今日仍為羅馬最重要之天主教學府），除了研習神學、哲學、歷史、修辭、文學、語法、詩歌之外，還學習科學之基礎的數學、天文學、建築學等學科，對地理、機械亦有所涉獵。耶穌會（拉丁文：Societas Iesu，英文：Jesuits）是十六世紀中期，一些年輕的天主教教士，為回應當時勢不可擋的宗教運動，所成立的修道會。十六世紀初，馬丁路德等人針對當時天主教會的腐敗，推動宗教改革，不少歐洲國家、城邦脫離天主教會，創立新教，猛烈的宗教改革浪潮對天主教衝擊非常大，天主教內產生了一股維新改革的力量。西班牙巴斯克貴族依納爵·羅耀拉（Ignatius of Loyola ，1491年－1556年）在戰爭中受傷，在養傷期間，他閱讀了各種宗教的小冊子，從而引起了信仰危機。他決心改變過去的荒唐生活，獻身為天主服務。其後他到巴塞隆拿、巴黎等地遊學，結識同道中人，為改革天主教而努力。1534年8月15日，羅耀拉與其他巴黎大學學生方濟各·沙勿略（Francis Xavier）在等六人，在巴黎郊外聖但尼小教堂的地下室成立了耶穌會。其宗旨是內部改革天主教會，同時希望能以此獲得更靠近耶穌地位。重視神學教育、對教會的忠誠度以及向青年傳教，由於羅耀拉有軍官背景，他規定修會的成員必須對教宗聖座的命令絕對服從。並將耶穌會的會士們建立成為一個有紀律、有中心、有操練的組織，他們宣誓守三條規律：清貧、守貞、服從。耶穌會注重學習計晝，並且廣設學校，在羅馬、德國、希臘、匈牙利，和英國建立學院，招收優秀青年為學生，推向當時認知的世界推廣天主教。羅耀拉的好友方濟各·沙勿略於1541年開始到東方，先後在印度、日本、中國傳播天主教，並死在中國廣東上川島，成為耶穌會向東方傳教的先驅。利瑪竇在羅馬學院第三年時，申請往遠方傳教，1577年，獲得耶穌會批准前往印度。當時他是二十五歲。