El 24 de junio de 1535 nació la tercera y última hija de Carlos I e Isabel de Portugal. Una vez más, Isabel tuvo un parto difícil, quedando su frágil salud muy mermada por el esfuerzo. El emperador, por su parte, había partido el 29 de mayo de ese mismo año hacia el norte de África con el propósito de conquistar la Goleta y Túnez para frenar el avance de los piratas turcos de Barbarroja. Tras la toma de las mismas, Barbarroja no tuvo mas remedio que huir y el emperador viendo la situación controlada regresó a Madrid

La infanta Juana fue bautizada algunos días después de su nacimiento, el 30 de junio, por el entonces cardenal primado de Toledo, Juan Tavera. Los padrinos de la princesa fueron su hermano y heredero al trono, el futuro Felipe II; Emanuel Felipe de Saboya príncipe del Piamonte y a la vez cuñado de Carlos I y el Condestable de Castilla Don Pedro Fernández de Velasco y Tovar III duque de Frías