Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Bereiche gegliedert. Der erste Themenbereich beschäftigte sich mit der Transformation von pflanzlichen Mitochondrien bzw. mit den Voraussetzungen, die erfüllt sein müssen, um Mitochondrien höherer Pflanzen zu transformieren. Im zweiten Themenbereich wurde die Regulation der Lysinbiosynthese erstmals mit Hilfe der Plastidentransformation modifiziert sowie ein universeller plastidärer Selektionsmarker entwickelt und etabliert.

Mitochondrientransformation-

In dieser Arbeit wurden zwei Strategien zur Transformation von Mitochondrien höherer Pflanzen entwickelt. Zum einen wurde ein mitochondrienspezifischer Ansatz gewählt, d.h. es wurden Selektionsmarker verwendet, die eine hemmende Wirkung auf die Atmungskette der Mitochondrien besitzen. Zum anderen wurden in Anlehnung an seit die seit 1990 erfolgreich durchführbare Plastidentransformation generelle Inhibitoren der Proteinbiosynthese verwendet, welche durch die Produkte der entsprechenden in die Mitochondrien eingebrachten Resistenzgene detoxifiziert werden sollten.

Markergenstrategie-

Geeignete Selektionsbedingungen zur Identifizierung von mitochondrialen Transformanten wurden bei Tabakblättern und Tabakprotoplasten mit den Antibiotika Blasticidin, Chloramphenicol und Hygromycin als Hemmstoffe ermittelt. Aus Transformationen mit den mitochondrialen Transformationskassetten pBMhph II, pBMhph III und pBMhph IV konnten über 200 Hygromycin-resistente Linien selektiert und charakterisiert werden. PCR- und Southern-Analysen lassen bei mindestens 7 Linien eine zielgerichtete mitochondriale Integration des Transgens vermuten. Möglicherweise sind aber nur wenige Kopien des Transgens in das Mitochondriengenom inseriert bzw. repliziert worden, was eine eindeutige Charakterisierung erschwert. Bei einer großen Anzahl resistenter Linien handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle zielortfremde Integrationen der Transformationskassetten in die Plastiden-, Kern- oder Mitochondriengenome.

Mitochondrienspezifischer Transformationsansatz-

Die in dieser Arbeit entwickelten mitochondrienspezifischen Transformationsvektoren pUMmyx II, pUMglu II, pUMarg II und pUManti II enthalten ein Fragment des mitochondrialen cob-Gens. In dieses cob-Fragment wurden Punktmutationen eingeführt, die zu einer Veränderung der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur des Apocytochroms b führen. Bei einer korrekten homologen Integration dieses modifizierten cob-Fragmentes in das Mitochondriengenom sind die Inhibitoren Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben nicht mehr in der Lage, an den Komplex III der mitochondrialen Atmungskette zu binden. Zur Bestimmung optimaler Selektionsbedingungen von mitochondrialen Transformanten mit den Hemmstoffen Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben wurden Testreihen mit Tabakblättern, Tabakprotoplasten sowie Tabak- und Arabidopsis-Suspensionskulturen durchgeführt. Bei „particle-gun“-Transformationen von Tabakblättern mit der Transformationskassette pUMarg II wurden 23 Moa-Stilben-resistente Linien selektiert. Bei 18 Linien konnte eine Integration des mutierten cob-Fragmentes eindeutig per PCR und Sequenzierung nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um eine mitochondriale Integration handelt, konnte nicht eindeutig belegt werden. In diesem Fall wäre jedoch zu klären, auf welchem Mechanismus der offensichtliche selektive Vorteil der mit dem Transformations-vektor transformierten Pflanzen beruht, da die Integration des cob-Gen-Fragmentes nur innerhalb des mitochondrialen Zielortes funktionell sein dürfte.

Plastidentransformation-

Bei dem plastidären Transformationsansatz dieser Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt. Zum einen wurde der „feedback“-Regulationsmechanismus der DHDPS innerhalb des Aspartat-Stoffwechsels durch die Integration eines insensitiven dhdps-Gens in die Plastiden von Tabak und Kartoffel beeinträchtigt. Der Gehalt der essentiellen Aminosäure Lysin wird somit gesteigert. Zum anderen wurde das insensitive dhdps-Gen als Markergen genutzt, um ein

GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) und NTN (Neurturin), die zwei zuerst beschriebenen Liganden der GDNF-Familie, fungieren als Überlebens- und Entwicklungsfaktoren für definierte Populationen von zentralen und peripheren Neuronen. GDNF ist darüber hinaus für die Nierenentwicklung erforderlich. Für die Vermittlung ihrer biologischen Wirkung benutzten GDNF und NTN einen Rezeptor, der aus zwei Ketten besteht: Die Signal-transduzierende Komponente RET wird sowohl von GDNF als auch von NTN benutzt. RET wird von 21 Exonen kodiert und kommt in multiplen Spleiß-Varianten vor. Für die Liganden-Spezifität ist eine zweite Rezeptorkomponente verantwortlich, ein Mitglied der GFR-Familie. GFRa-1 bindet präferentiell GDNF, während GFRa-2 NTN stärker als GDNF bindet.

Ziel dieser Arbeit war es, mögliche wechselseitige Interaktionen zwischen dem Nerven- und Immunsystem durch die GDNF-Familie zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Expression von GDNF, NTN und ihrer Rezeptoren in gereinigten Immunzell-Subtypen untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Prototyp dieser Liganden-Familie, GDNF, von keiner der untersuchten Immunzellen exprimiert wurde. Hingegen wurde das verwandte NTN von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten exprimiert wie mit RT-PCR, Western Blot und Immunzytochemie gesehen wurde. Transkripte für das zu NTN und GDNF verwandte Persephin (PSP) wurden in Monozyten und mononukleären Zellen des peripheren Blutes gefunden. Der Transmembran-Rezeptor RET wurde von allen untersuchten Immunzell-Subtypen exprimiert. B-Zellen und T-Zellen exprimierten unterschiedliche Isoformen von RET, sowohl im extrazellulären Liganden-bindenden als auch im intrazellulären Signal-transduzierenden Teil. Die Expression der Isoformen von RET wurde zudem in T-Zellen und B-Zellen noch stark durch Aktivierung reguliert. In CD8+ T-Zellen wurde auch eine bislang noch nicht beschriebene Spleiß-Variante am 5` Ende beobachtet. Im Gegensatz zu T-Zellen und B-Zellen exprimierten Monozyten nur die volle Länge von RET.

Auch die Liganden-bindenden Ketten GFRa-1 und GFRa-2 wurden von Immunzellen exprimiert wie mit RT-PCR und FACS gesehen wurde. GFRa-2 war deutlich abundanter als GFRa-1. Von GFRa-2 wurden verschiedene Isoformen in Immunzellen gefunden. In der in T-Zellen und B-Zellen am stärksten exprimierten Isoform ist Exon 2 und 3 nicht enthalten. Dem resultierenden Protein fehlen die N-terminale Cystein-reiche Domäne und eine N-Glykosylierungsstelle, eine Region, die allerdings für die Bindung von NTN und die Interaktion mit RET entbehrlich ist.

Mögliche Effekte von GDNF und NTN auf Immunzellen wurden untersucht. Dabei zeigte sich, dass GDNF und NTN an der Regulation von TNF-alpha beteiligt sind. Wenn GDNF oder NTN nach 5 oder 6 Tagen zu LPS+IFN-g stimulierten Blutzellen oder zu ConA aktivierten T-Zellen gegeben wurde, dann war nach weiteren 24 h der TNF-a-Gehalt im Überstand reduziert. Weitere Experimente wiesen daraufhin, dass diese Reduktion des TNF-a-Gehalts auf eine verstärkte Aufnahme oder Verbrauch zurückzuführen ist. Proliferation, Expression von Aktivierungsmarkern (HLA-DR, CD38, CD40, CD69, CD86) oder Produktion von IFN-g und IL-4 wurden durch GDNF und NTN nicht beeinflusst.

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Immunzellen den neurotrophen Faktor NTN produzieren und Rezeptoren für GDNF und NTN besitzen. Multiple Isoformen der Signal-transduzierenden Kette RET wurden exprimiert und durch Aktivierung reguliert. NTN und GDNF regulierten in aktivierten T-Zellen und Monozyten die Aufnahme oder den Verbrauch von TNF-a. Diese Befunde weisen daraufhin, dass Immunzellen miteinander und auch mit dem Nervensystem mit Hilfe der GDNF-Familie interagieren können.

The centrosome is the major microtubule organizing centre (MTOC) in animal cells. Most microtubules (MTs) emanate from the centrosome, where gamma-tubulin ring complexes (gammaTuRCs) act as templates for MT nucleation. During interphase, the centrosome organizes a MT array that imparts shape and polarity to the cell and is essential for intracellular transport and positioning of organelles such as the Golgi apparatus. During mitosis, centrosomes ensure bipolarity and correct orientation of the spindle by forming the spindle poles. In order to switch from the interphasic to the mitotic state, the centrosome undergoes a structural reorganization, termed maturation, which is mainly characterized by an increase in MT nucleation activity.

A full appreciation of how centrosomes contribute to cellular functions requires the isolation and characterization of unknown centrosome-associated molecules. Here we describe the identification and characterization of a novel centrosomal component, the human protein Nlp (ninein-like protein) related to the previously characterized MT-anchoring protein ninein.

In the first part of the present thesis we describe the identification of Nlp as a novel centrosomal substrate of Polo-like kinase 1 (Plk1), an important regulator of mitosis whose activity is required for centrosome maturation. Nlp interacts with two distinct gammaTuRC components, gamma-tubulin and hGCP4, and stimulates MT nucleation. Plk1 phosphorylates Nlp and disrupts its centrosomal association. Overexpression of an Nlp mutant lacking Plk1 phosphorylation sites induces defects in mitotic spindle formation. We propose that Nlp acts as a gammaTuRC binding protein (GTBP), contributing to the MT nucleation activity of the centrosome during interphase. At the onset of mitosis, the displacement of Nlp from the centrosome triggered by Plk1 phosphorylation could represent an important step in the maturation process which allows the centrosome to switch from the interphasic to the mitotic state.

Thus, we conclude that Nlp, as well as the related protein ninein, plays an important role in MT organization. However the function of these two proteins possibly diverged during evolution: whilst Nlp gained a more prominent role in MT nucleation, ninein became principally involved in MT anchoring.

In the second part of this thesis we report the initial characterization of the molecular mechanisms underlying the ability of Nlp and ninein to induce the fragmentation of the Golgi apparatus when overexpressed in human cells. We show that the ability of these two centrosomal proteins to affect the organization of the Golgi clearly depends on their capacity to associate with the cytoplasmic dynein-dynactin complex, a molecular motor complex primarly involved in the maintainance of Golgi architecture. We propose that the excess of Nlp and ninein could induce the disruption of the Golgi apparatus by sequestering the dynein-dynactin complexes.

Future investigations should be aimed at understanding whether the dissociation of the Golgi apparatus from the centrosome induced by the excess of Nlp and ninein could interfere with cell migration and cell polarization processes, which require a highly coordinated action of these two organelles. Cell migration and cell polarization represent critical events for immune responses as well as for embryonic development, invasive growth and metastasis. Thus, our findings raise the interesting possibility that an upregulation in the expression levels of structural centrosomal proteins could represent the molecular basis for developmental disorders and malfunctioning of the immune system and, on the other hand, modulate the acquisition of invasive properties by neoplastic cells.

Das humanpathogene Bakterium H. pylori persistiert im Gastroduodenaltrakt für Jahre oder

sogar Jahrzehnte und löst durch die Kolonisation der Magenmukosa eine chronische

Entzündungsreaktion aus. In den meisten Fällen bleibt diese symptomlos, es können jedoch

auch schwerwiegende Erkrankungen wie ein Magen- oder Zwölffingerdarm-Geschwür oder

Magenkrebs daraus hervorgehen. Obwohl die Infektion eine starke zelluläre und humorale

Immunantwort hervorruft, kann H. pylori durch das Immunsystem nicht eliminiert werden. In

dieser Arbeit wurde der Einfluss von H. pylori auf die Proliferation und Aktivierung von CD4+

T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass H. pylori zwei Faktoren besitzt, um die

Expansion der T-Zellen zu hemmen. Der eine, nicht näher charakterisierte Faktor scheint mit

der Oberfläche der Bakterien assoziiert zu sein und inhibiert die Proliferation der T-Zellen bei

direktem Kontakt der Bakterien mit den Zellen. Der zweite Faktor wurde als vakuolisierendes

Zytotoxin VacA identifiziert, das, wie bisher bekannt war, in Epithelzellen die Bildung saurer

Vakuolen auslöst. T-Zellen produzieren, wenn sie aktiviert werden, den Wachstumsfaktor IL-

2, beginnen sich zu vermehren und setzen eine Immunreaktion gegen das Pathogen in

Gang. Das VacA-Toxin hemmt jedoch die Bildung von IL-2 und bewirkt eine Hemmung des

Zellzyklus bei T-Zellen, indem es die Expression der Cycline D3 und E reprimiert. Diese sind

essentiell für die Aktivierung des Retinoblastom-Proteins, das den Übergang des Zellzyklus

von der G1- in die S-Phase vermittelt. Durch die Hemmung der IL-2-Produktion und die

Erniedrigung der Oberflächenlokalisation von CD25, der -Kette des IL-2-Rezeptors,

unterbricht VacA die Signaltransduktion, die normalerweise über den IL-2-Rezeptor zur

Expression der Cycline führt. Die Hemmung der IL-2-Produktion durch VacA erfolgt auf

transkriptioneller Ebene, indem die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear

Factor of Activated T cells) verhindert wird. Die anderen für die Transkription des IL-2-Gens

essentiellen Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-B werden durch VacA nicht beeinflusst.

Die Stimulation der T-Zellen aktiviert zwei Haupt-Signalwege: einer führt über den MAPKinase

/ ERK-Kinase Weg zur Aktivierung von AP-1 und NF-B, der andere löst eine

Erhöhung der Calcium-Konzentration im Zytoplasma aus, was die Ca2+-abhängige

Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert daraufhin den

Transkriptionsfaktor NFAT und NFAT wird in den Zellkern transportiert, wo es zusammen mit

AP-1 und NF-B die Transkription des IL-2-Gens initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass

VacA die Translokation von NFAT in den Kern durch Hemmung der Phosphatase-Aktivität

von Calcineurin verhindert. Dies hat zur Folge, dass NFAT-abhängige Gene, wie das IL-2-

Gen oder das für CD25 codierende Gen, nicht abgelesen werden können. Dass Calcineurin

ein geeignetes Zielmolekül ist, um eine Immunantwort zu unterdrücken, zeigen auch die

medizinisch bedeutsamen Substanzen FK506 (Tacrolimus) und Cyclosporin A. Beide

V Zusammenfassung

91

Substanzen verursachen durch Hemmung von Calcineurin eine starke Immunsuppression. In

DNA-Microarray-Analysen wurde untersucht, ob VacA einen ähnlich drastischen Effekt auf

die Funktion der T-Zellen hat wie FK506. Dabei zeigte der Vergleich der Genexpression von

VacA- und FK506-behandelten T-Zellen, dass VacA eine Untergruppe der Gene, die auch

von FK506 reprimiert werden, herunterreguliert, wie z.B. die Gene für die Zytokine

Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1, MIP-1, Single C Motif-1 (SCM-1) und SCM-

1. VacA scheint also die Genaktivität von T-Zellen ähnlich wie FK506 zu modulieren, was

auf einen ähnlichen Mechanismus, nämlich die Calcineurin-Hemmung schließen lässt. Da

das VacA-Toxin ein sekretiertes Protein ist, das auch in den tieferen Schichten des

Magengewebes nachgewiesen werden kann, erreicht H. pylori nicht nur die vereinzelt im

Magenepithel vorkommenden T-Zellen, sondern auch die T-Zellen, die bei der Infek

Es wurden unterschiedliche Verfahren zur selektiven Pigmentmodifikation in der BChl-B800 Bindungstasche bei peripheren Lichtsammel-Komplexen verschiedener Purpurbakterien etabliert und optimiert, sowie die spektralen Eigenschaften und Pigment- und Proteinzusammensetzung dieser modifizierten Antennen untersucht und miteinander verglichen.

>>Novel bacteriochlorophyll e structures and species-specific variability of pigment composition in green sulfur bacteria<<

The relative composition of bacteriochlorophyll (BChl) homologs in five different strains of brown-colored green sulfur bacteria was investigated by HPLC-MS/MS and NMR analyses. In addition, the effect of incubation light intensities on homolog distribution was studied in one of the strains (strain Dagow III). A total of 23 different BChl e structures were detected and comprise four homologous porphyrin ring systems and eight different esterifying alcohols. Several BChl e structures are novel. These include a C-8 ethyl, C-12 methyl [E,M] BChl eF homolog which was identified by 1H-NMR analyses of the isolated, main farnesyl homologs (BChl eF). In addition, five previously unknown homolog series with dodecanol, pentadecenol, tetradecanol, hexadecenol and phytol as the esterifying alcohols were detected. The composition of BChl e homologs from the five strains of green sulfur bacteria differed with respect to the relative abundance of the homologs (BChl eF: 25.6 to 67.0% of total BChl e content in stationary cultures). In strain Dagow III, the abundance of BChl eF homologs decreased upon entry into the stationary phase. In all free-living strains, the abundance of BChl eF was increased when the relative carotenoid content was low. The present results provide a more detailed picture of pigment composition in chlorosomes and thus will help to elucidate their structure and function. Furthermore, the newly discovered BChl e molecules are valuable biomarkers for the study of the occurrence and the metabolism of green sulfur bacteria in past and present ecosystems.

>>Characterization and in situ carbon metabolism of phototrophic consortia<< A dense population of the phototrophic consortium "P. roseum" was investigated in the chemocline of a temperate holomictic lake (Lake Dagow, Brandenburg, Germany). Fluorescent in situ hybridization revealed that the brown-colored epibionts of "P. roseum" constituted up to 37 % of total bacterial cell numbers and up to 88 % of all green sulfur bacteria present in the chemocline. Specific amplification of 16S rRNA gene fragments of green sulfur bacteria and DGGE fingerprinting yielded a maximum of 4 different DNA bands depending on the year of study, indicating a low diversity of green sulfur bacteria. The 465 bp-long 16S rRNA gene sequence of the epibiont of "P. roseum" was obtained after sorting individual consortia by micromanipulation, followed by a highly sensitive PCR. The sequence obtained represents a new phylotype within the radiation of green sulfur bacteria. A maximum of light-dependent H14CO3- fixation in the chemocline in the presence of DCMU suggested anaerobic autotrophic growth of the green sulfur bacteria. The metabolism of the epibionts was further studied by determination of stable isotope ratios (d13C) of their specific biomarkers. Analysis of photosynthetic pigments by HPLC revealed the presence of high concentrations of BChl e and smaller amounts of BChl a, d and Chl a in the chemocline. Unexpectedly, isorenieratene and b-isorenieratene, carotenoids typical for other brown-colored members of the green sulfur bacteria, were absent. Instead, four different esterifying alcohols of BChl e were isolated as biomarkers of green sulfur bacterial epibionts, and their d13C measured. Farnesol, tetradecanol, hexadecanol and hexadecenol all were significantly enriched in 13C compared to bulk dissolved and particulate organic carbon, and compared to the biomarkers of purple sulfur bacteria. The difference (Dd13C) between d13C values of farnesol, the major esterifying alcohol of BChl e, and CO2 was -7.1‰, which provides clear evidence for a photoautotrophic mode of growth of the green sulfur bacterial epibionts of "P. roseum" in situ.

>>The significance of organic carbon compounds for in situ metabolism and chemotaxis of phototrophic consortia<<

The significance of organ