Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

This study focuses on one brown-colored representative of the green sulfur bacteria, Chlorobium sp. BS-1, that survives by means of anoxygenic photosynthesis even at very low light intensities. This unusual representative of the green sulfur bacteria lives in the chemocline of the Black Sea, which is located at 80 to 120 m depth, offering only 0.0005 % (winter) to 0.002 % (summer) of surface irradiance (0.00075 to 0.0022 µmol Quanta m-2 s-1). The Black Sea represents the world’s biggest anoxic water body, and it is permanently stratified. An overview of the habitat Black Sea and the research on phyotosynthetic bacteria in the Black Sea chemocline gives the article Anoxygenic phototrophic bacteria in the Black Sea chemocline (pages 53 ff.)

In the second article, Physiology and phylogeny of green sulfur bacteria forming a monospecific phototrophic assemblage at 100 m depth in the Black Sea (pages 75 ff.), it is shown that Chl. sp. BS-1 represents a novel phylotype in the marine cluster of green sulfur bacteria and is the only detectable phylotype of green sulfur bacteria in the Black Sea chemocline. It was shown that Chl. sp. BS-1 is the first organism known to date which fixes 14CO2 under laboratory conditions even at light intensities as low as 0.015 µmol Quanta m-2 s-1 which is much lower than the light intensity in any typical habitat of green sulfur bacteria. Therefore it is the best adapted species to extremely low light intensities documented. The major adaptive mechanism to extremely low light intensities might be a significant change in the secondary homologs of the main photosynthetic pigment, bacteriochlorophyll e (BChl e). The dominance of farnesyl esters and the presence of four unusual geranyl ester homologs of BChl e were revealed by HPLC analysis in cells shifted from 3 to 0.1 µmol Quanta m-2 s-1. Together with in situ light measurements and in situ BChl e concentrations, the growth experiments allowed for the calculation of doubling times and significance of the photosynthetic activity for the carbon and sulfur cycle in the Black Sea chemocline. With doubling times of a minimum of 3.1 years (for summer light intensity) and the contribution of only 0.002 - 0.01 % to total sulfide oxidation in the chemocline Chl. sp. BS-1 represents the slowest growing population of green sulfur bacteria known to date and does not contribute significantly to the carbon or sulfur cycle.

The article Subfossil DNA sequences of green sulfur bacteria as indicators for past water column anoxia in the Black Sea (page 119 ff.) gives insight into the history of the strain Chl. sp. BS-1 and the green sulfur bacteria in the Black Sea during the last few thousand years. The Black Sea today is considered as closest contemporary analogue to past sulfidic oceans and its biogeography over several thousand years is well documented in its stratified sedimentary record. Since the 16S rRNA gene sequence of Chl. sp. BS-1 might be a useful indicator for past photic zone anoxia, the presence of its fingerprints in past periods of the Black Sea was investigated. 16S rRNA gene sequences of green sulfur bacteria from samples of Black Sea sediments up to 7 m below seafloor were amplified and sequenced. Nine green sulfur bacterial 16S rRNA gene sequences were identified. Surprisingly, not only green sulfur bacterial fingerprints were found but also closely related species clustering at the basis of the green sulfur bacterial subtree, together with not yet cultured species detected all over the world. The new cluster was called “deep-branching green sulfur bacteria” though it was not possible to enrich live organisms with medium for photosynthetic green sulfur bacteria. The chemocline strain Chl. sp. BS-1, found in Units III, II and I (>9000 years b.p. until today), and two other sequences, found in sediments of Unit IIb (between 8200 yr. b.p. and 5000 yr.b.p) only, were the only two sequences clustering with the marine green sulfur bacteria. The other gr

Bacterial interactions play a major role in nature, but are poorly understood, because of the lack of adequate model systems. Phototrophic consortia represent the most highly developed type of interspecific bacterial association due to the precise spatial arrangement of phototrophic green sulfur bacteria (GSB) around a heterotrophic central bacterium. Therefore, they are valuable model systems for the study of symbiosis, signal transduction, and coevolution between different bacteria. This thesis summarizes a series of laboratory experiments with the objective of elucidating the molecular, physiological and phylogenetical properties of the two bacterial partners in the symbiotic phototrophic consortium "Chlorochromatium aggregatum".

The central bacterium of “C. aggregatum” had been identified as a Betaproteobacterium, however, it could not be characterized further due to the low amount of consortia in enrichment cultures. In this work a suitable method for enrichment and isolation of DNA of the central bacterium of "C. aggregatum" has been established using cesium chloride-bisbenzimidazole equilibrium density gradient centrifugation (Chapter 3). In density gradients, genomic DNA of the central bacterium of “C. aggregatum” formed a distinct band, which could be detected by real-time PCR. Using this method, the GC-content of the central bacterium was estimated to be 55.6%. Furthermore, its precise phylogenetic position was determined and it was shown to represent a novel and phylogenetically isolated lineage of the Comamonadaceae within the -subgroup of the Proteobacteria.

Chapter 4 describes the detection of a new, highly diverse subcluster of Betaproteobacteria, which contains several central bacteria of phototrophic consortia. Genomic DNA of the central bacterium of “C. aggregatum” was enriched several hundred fold by employing a selective method for growth of consortia in a monolayer biofilm followed by a purification of the central bacterial genome by density gradient centrifugation. A combination of molecular methods revealed that two rrn operons of the central bacterium are arranged in a tandem fashion. This rare gene order was exploited to screen various natural microbial communities. A diverse and previously unknown subgroup of Betaproteobacteria was discovered in the chemocline of Lake Dagow, Eastern Germany. All 16S rRNA gene sequences recovered are related to that of the central bacterium of “C. aggregatum”. Phylogenetic analyses showed, that the central, chemotrophic symbionts of phototrophic consortia have a polyphyletic origin, just like their phototrophic counterparts. This indictates that not only different GSB but also different Betaproteobacteria have adapted to life in this type of symbiosis.

Chapter 5 focuses on the isolation of the epibiont of “C. aggregatum” from a consortia enrichment culture and its description as Chlorobium chlorochromatii strain CaD. It represents a novel species within the genus Chlorobium and is characterized by physiological properties typical for GSB. However, the symbiotic strain differs from free-living GSB in the distribution of its chlorosomes and the presence of a conspicuous additional structure at the attachment-site to the central bacterium. Its capability to grow in pure culture indicates that it is not obligately symbiotic.

The natural habitat of GSB and phototrophic consortia is the chemocline of stratified lakes. Therefore, the physiological response to oxygen exposure of the epibiont and the free-living GSB Chlorobium limicola has been investigated (Chapter 6). It was shown that GSB are able to survive oxygen exposure and have developed several strategies for oxygen detoxification. Genome annotation revealed the presence of several enzymes involved in oxygen detoxification in all currently sequenced GSB genomes. Phylogenetic analyses showed that most of these enzymes likely were present in the common ancestor of this group. The activity of some of those enzymes cou

TRADD spielt als Adaptermolekül eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion von LMP1 und TNF-Rezeptor 1. Während es allerdings durch den TNFR1 neben der Aktivierung verschiedener Signalwege auch zur Induktion von Apoptose und Nekrose kommt, handelt es sich bei LMP1 um ein Protein mit transformierendem Potential. Bei den jeweiligen TRADD-Bindestellen von LMP1 und TNFR1 handelt es sich um zwei strukturell vollkommen unterschiedliche Domänen. Und auch auf der Seite von TRADD wird die Bindung über zwei verschiedene Domänen vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob die TRADD-Bindestelle intrinsisch die biologischen Effekte der Signaltransduktion bestimmt oder ob diese durch den Rezeptorkontext festgelegt werden. Zur Beantwortung dieser Frage wurde in einem Domain Swapping Experiment die TRADD-Bindestelle des konstitutiv aktiven LMP1-TNFR1 sowie des TNFR1 gegen die putative TRADD-Bindestelle von LMP1 ausgetauscht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die

Aminosäuren 370-386 die vollständige TRADD-Bindestelle von LMP1 umfassen. Weiter konnte gezeigt werden, dass diese Aminosäuren im LMP1-TNFR1- sowie im TNFR1-Kontext ausreichend sind, um den NF-κB und den JNK1 Signalweg zu aktivieren. Die Aktivierung des JNK1 Signalweges durch LMP1-TNFR1-CTAR2 verläuft unabhängig von TRAF2 und abhängig von TRAF6 und auch die Aktivierung des NF-κB Signalweges durch dieses Rezeptorkonstrukt verläuft TRAF6-abhängig. Damit konnte gezeigt werden, dass die LMP1-spezifischen Charakteristika der Signaltransduktion durch die TRADD-Bindestelle festgelegt und mit ihr zusammen übertragen werden. Obwohl die Aminosäuren 370-386 von LMP1 funktionell sind, sind sie auch im LMP1-TNFR1 sowie im TNFR1 Kontext nicht in der Lage Apoptose zu induzieren. Damit konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass die Aminosäuren 370-386 von LMP1 intrinsisch und unabhängig vom Rezeptorkontext den nicht-apoptotischen Phänotyp der Signaltransduktion festlegen.

Außerdem wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit die Beteiligung von TRAF7 an der Signaltransduktion von LMP1 untersucht. Dazu wurde traf7 aus einer cDNA kloniert.

Zusätzlich wurden verschiedene Deletionsmutanten sowie Fusionen mit dem fluoreszierenden Protein mRFP hergestellt. Es konnte eine Threonin-Phosphorylierung von TRAF7(1-383)

nachgewiesen werden. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Lokalisierung von TRAF7 in vesikulären Strukturen beobachtet werden. Eine Mutante, der der RING- sowie der

Zink-Finger fehlen, zeigte hingegen eine gleichmäßige zytosolische Verteilung. Außerdem konnte in dieser Doktorarbeit mit Hilfe von spezifischer siRNA gezeigt werden, dass TRAF7 an der Aktivierung des JNK1 Signalweges durch LMP1 beteiligt ist.

Für die Assemblierung des bakteriellen Flagellums müssen die externen Untereinheiten an ihren Bestimmungsort transportiert werden. Dies geschieht wie bei allen Gram-negativen Bakterien auch in Escherichia coli mit Hilfe des flagellären Typ III-Sekretionssystems (fTTSS). Dabei ist der flagelläre Exportapparat mit seinen cytoplasmatischen Komponenten FliH, FliI und FliJ von Bedeutung. Der Exportapparat ist im Basalkörper des Flagellums lokalisiert und liefert die Energie für den Export der Substrate, wie z. B. das Hakenkappenprotein FlgD und das Hakenprotein FlgE. Die Substrate benötigen ihrerseits ein Signal für die Erkennung durch den Exportapparat.

Im Rahmen dieser Arbeit konnten Interaktionen zwischen den löslichen Komponenten FliH, FliI und FliJ des flagellären Typ III-Sekretionssystems von E. coli K12 festgestellt werden. Zudem wurden begonnene Arbeiten zur Lokalisation und Beschaffenheit einer Erkennungssequenz für den Exportapparat beim Substrat FlgD weitergeführt und auch das Substrat FlgE näher untersucht.

Mit Hilfe der Affinitätschromatographie konnte ein Komplex, bestehend aus FliH, FliI und FliJ, aus dem Cytosol von E. coli BL21 (DE3) präpariert werden. Dafür wurden zuvor die Gene fliH, fliI und fliJ zusammen in den Vektor pASK-IBA 45 kloniert und dann exprimiert. Parameter für Interaktionen und Affinitäten zwischen zuvor einzeln präpariertem FliH, FliI und FliJ konnten mit Hilfe von isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Surface Plasmon Resonance (SPR) ermittelt werden.

Unter Verwendung eines bereits etablierten Testsystems für das fTTSS in E. coli CC181-Mutanten konnte der Export der Hybridproteine FlgDPhoA bzw. FlgEPhoA untersucht werden. Dabei wurden von FlgD auch N- oder C-terminale Verkürzungen sowie auf Nukleotid- oder Aminosäureebene veränderte Sequenzen eingesetzt. Die Untersuchungen ergaben ein Signal für den Export des Hakenkappenproteins FlgD auf Proteinebene und nicht auf der Ebene der mRNA. Zudem konnte das Exportsignal auf die N terminalen 71 Aminosäuren von FlgD eingegrenzt und eine Bedeutung des möglichen zweiten Startcodons an Position 52 in flgD für den Export ausgeschlossen werden. FlgE wurde in seiner gesamten Länge vom fTTSS transportiert. Im Gegensatz zu FlgD führten jedoch alle C-terminalen Verkürzungen von FlgE zum Transportverlust.

Mitglieder der evolutionär konservierten Oxa-Proteinfamilie wirken an der korrekten Insertion von integralen Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit. In den sehr proteinreichen Thylakoidmembranen der Chloroplasten höherer Pflanzen spielt das Oxa-Homolog Alb3 eine essentielle Rolle bei der Integration von LHC-Proteinen und weiteren Komponenten des Photosynthese-Apparates.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres Protein aus Arabidopsis identifiziert und als neues Mitglied der Oxa-Proteinfamilie beschrieben. Die experimentell gestützte Annotation zeigt, dass das Alb4-Protein eine zentrale 60KD_IMP-Domäne besitzt, welche für die Oxa-Proteine charakteristisch ist. Die Zugehörigkeit zur Oxa-Proteinfamilie konnte funktionell durch die Komplementation einer Hefe-oxa1-Mutante bestätigt werden. Immunologische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnten weiterhin zeigen, dass es sich bei Alb4 um ein chloroplastidäres Protein handelt, welches als integrales Membranprotein in den Thylakoiden lokalisiert ist. Durch die Analyse von T-DNA-Insertions- und RNAi-Linien konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion des Alb4-Gehaltes zu vergrößerten und nicht länger linsenförmigen Chloroplasten führt, in denen die Thylakoidmembranen aufgelockerter erscheinen. Ein Verlust der Lebensfähigkeit konnte jedoch nicht beobachtet werden, selbst wenn der Alb4-Gehalt in den Chloroplasten der Pflanzen um mehr als 90% reduziert war. Im Vergleich zu Cyanobakterien besitzt die Thylakoidmembran von Arabidopsis mit Alb4 und Alb3 gleich zwei Oxa-Homologe. Möglicherweise ist nach der Umwandlung des cyanobakteriellen Endosymbionten zu einem eukaryotischen Organell diese Duplizierung nötig geworden, um sowohl die Ausbildung als auch den Erhalt der Thylakoidstruktur zu gewährleisten.

Zusätzlich zur Identifizierung von Alb4 konnte durch Transkript-Analysen desweiteren gezeigt werden, dass auch der N-Terminale Teil des ehemaligen Genmodells F21J9.13 (Artemis, nun Alb4 und RWK1) für ein eigenständiges Gen kodiert. Das abgeleitete Protein aus dem N-terminalen Teil, RWK1, ähnelt dem Rezeptor-Teil von pflanzlichen Rezeptor-Kinasen, eine entsprechende Kinase-Domäne fehlt jedoch vollständig. RWK1 kommt in zwei Spleißvarianten vor, der für die meisten eukaryotischen mRNAs typische polyA-Schwanz fehlt jedoch beiden Varianten. RWK1 könnte als neuartiger Rezeptor ein weiteres Glied in der internen Kommunikationskette der Zelle bilden.

Late mitotic events are chiefly controlled by proteolysis of key regulatory proteins via the ubiquitin-proteasome pathway. In this pathway ubiquitin ligases modify substrates by attachment of ubiquitin (“ubiquitylation”), which usually results in their subsequent degradation by the 26S proteasome. The crucial ubiquitin ligase involved in late mitosis is the anaphase-promoting complex or cyclosome (APC/C). Among the many substrates of the APC/C is the anaphase inhibitor securin, whose destruction leads to activation of separase, which in turn triggers sister chromatid separation by proteolytic cleavage of cohesin. The APC/C also targets cyclin B1, an activating subunit of Cdk1 kinase, whose inactivation is a prerequisite for mitotic exit. The unstable APC/C substrates are often found in association with stable partner proteins. How single subunits of multi-protein complexes are selectively extracted and eventually degraded is largely unknown, but there is increasing evidence that additional factors assist to extract ubiquitin-carrying subunits from stable binding partners. One such factor is vertebrate p97 (Cdc48 in yeast), an abundant and highly conserved member of the AAA-ATPase family. It is involved in such diverse processes as transcriptional regulation, membrane fusion, and ER-associated protein degradation (ERAD). The unifying scheme in these seemingly unrelated functions is that p97 is able to “extract” preferentially ubiquitylated proteins from their environment. Roles of p97 in mitosis have recently emerged: p97 was reported to be required for spindle disassembly and for nuclear envelope reformation during mitotic exit in Xenopus. Furthermore, a genetic interaction between p97, separase and securin, as well as a requirement of p97 for separase stability, were discovered in fission yeast.

Given these hints and the importance of ubiquitylation in both mitosis and p97 pathways, this study intended to elucidate additional mitotic roles of p97 in vertebrates. Towards this end, tools to interfere with p97 function in Xenopus egg extracts were developed. These included immunodepletion of the p97 adaptors Npl4, Ufd1 and p47 and addition of recombinant dominant-negative p97-mutants. ERAD, which could be established here for the first time in Xenopus egg extracts, was greatly impaired in the absence of p97 function. However, many aspects of mitosis were found to be unaffected. Importantly, p97’s proposed role in spindle disassembly was clearly falsified within this thesis. Furthermore, p97 was shown to be dispensable for activity and stability of vertebrate separase. Disassembly of the mitotic checkpoint complex, which prevents premature APC/C activation by sequestering its activator Cdc20, did also not require functional p97 despite its dependence on ubiquitylation of Cdc20. However, a novel function of p97 at fertilization was discovered. p97 was found to interact with nucleoplasmin, a histone-binding chaperone that catalyzes the exchange of sperm-specific basic proteins (SBPs) to histones. Indeed, interference with p97 function delayed sperm decondensation in Xenopus egg extracts, thereby confirming a novel role of this AAA-ATPase in sperm chromatin remodelling.

In another project the role of securin in human cells was investigated. Human cells lacking securin had been reported to suffer from massive chromosome missegregation, which was in sharp contrast to the mild phenotype of securin knockout mice. In collaboration with the group of M. Speicher it could be demonstrated that chromosome losses in securin-/- cells are transient and give way to a stable segregation pattern after just a few passages. This was despite persisting biochemical defects such as reduced level and activity of separase. These data demonstrate that securin is dispensable for chromosomal stability in human cells.