Die vorliegende Dissertation stellt die Ergebnisse der Untersuchungen auf zwei Themengebieten

vor: Synthese und Struktur neuer Organophosphor-Chalkogen-Verbindungen

ausgehend von speziellen Dichlorphosphanen RPCl2 durch Kondensation mit Natriumchalkogeniden

Na2Chx (x = 1,2; Ch = S, Se, Te) einerseits sowie erstmalige Untersuchungen zur

Synthese und Struktur kationischer Phosphor-Chalkogen-Polycyclen andererseits.

Als Edukte wurden Dichlorphosphane mit besonderen sterischen, elektronischen oder mobilen

Eigenschaften der organischen Substituenten verwendet. Es gelang für neun solche Dichlorphosphane

mit zum Teil sehr unterschiedlichen Eigenschaften Synthesen zu optimieren oder neu

zu entwickeln. Erstmals wurden Aroxy- und Alkoxydichlorphosphane sowie das Trifluormethyldichlorphosphan

strukturell durch Röntgenbeugung an Einkristallen untersucht.

Mit den neun Dichlorphosphanen wurden systematische Untersuchungen der Kondensationsreaktionen

mit Natriumchalkogeniden, insbesondere mit Natriumseleniden und -telluriden,

durchgeführt. Dabei wurde eine ganze Reihe neuer Verbindungen in den quasibinären Systemen

RP/Se und RP/Te identifiziert und charakterisiert. Es konnten die ersten Kristallstrukturen von

Triselenatriphosphinanen (RP)3Se3, die erste Struktur eines Telluratriphosphetans (AdP)3Te und

die erste Kristallstruktur eines durch eine Se4-Brücke verbundenen Selenodiphosphatdiesters

erhalten werden. Eine Vielzahl weiterer neuer Verbindungen wurde NMR-spektroskopisch identifiziert

und charakterisiert, darunter viele neue P/Te-Heterocyclen wie z.B. Ditelluradiphosphetane,

Tritelluratriphosphinane und Ditelluratriphospholane.

Bei den Selenophosphonatanionen konnten von vielen Substanzklassen neue Vertreter erstmals

strukturell untersucht werden. So wurden mehrere Strukturen der Natriumsalze von Triselenophosphonatanionen

und Selenodiphosphonatanionen mit einer Diselenidbrücke untersucht. Es

werden das erste strukturell untersuchte Triphosphonat und Triselenoxodiphosphonat ebenso

vorgestellt wie drei neue Natriumsalze von Diselenophosphatestern.

Das zweite Forschungsgebiet bestand aus systematischen Untersuchungen der Synthese und

Struktur von Organophosphor-

Chalkogen-Kationen. Untersucht wurde die direkte Alkylierung

der Phosphorchalkogenide P4S3 und P4Se3 mit Alkyl- oder Arylhalogeniden, welche zu neue Kationen

RP4Chx

+ (x = 3, 4, 5) führten. Diese Kationen wurden durch Heterokern-NMR-Spektroskopie

identifiziert und ihre Struktur in Lösung aufgeklärt. Von dem zu α-P4S5 isolobalen Kation

AdP4S4+ konnte ein Röntgenbeugungsexperiment

an Einkristallen des Tetrachloroaluminatsalzes

durchgeführt werden. Ebenso wurde das erste P/Se/C-Kation P3Se3CH2+ röntgenographisch und

NMR-spektroskopisch untersucht. Der Höhepunkt der Arbeit ist die Synthese, Strukturbestimmung

durch Röntgenbeugung an Einkristallen und die vollständige 31P- und 77Se-NMR-spektroskopische

Charakterisierung des ersten binären Phosphor-Chalkogen-Kations [P3Se4+][AlCl4−]

überhaupt, welches Nortricyclenstruktur besitzt.

The present work follows a course of analytical description, formulation development, and practical application of (NF-κB decoy oligonucleotide-loaded) gelatin nanoparticles. The introduction of asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) in the analysis of colloidal drug carrier systems was exemplarily described for gelatin nanoparticles (CHAPTER I), stable freeze-dried formulations of empty and oligonucleotide loaded gelatin nanoparticles were successfully developed (CHAPTER II), and gelatin nanoparticles were proven as effective tool for the targeted delivery of an NF-κB decoy oligonucleotide to Kupffer cells within a hepatic ischemia reperfusion rat model (CHAPTER III).

Chaperonins are a specific class of barrel-shaped chaperones, present in almost all organisms. Newly synthesized proteins encapsulated by the chaperonin can attain their native structure unimpaired by aggregation during repeated cycles of ATP-dependent binding and release. Chaperonins are generally divided into two groups. Group I chaperonins, such as the barrel-shaped GroEL oligomer, are found predominantly in bacteria and cooperate with cofactors of the Hsp10 familly (i.e. GroES). The Group II chaperonins, on the other hand, do not require a Hsp10- cofactor and are found in the eukaryotic cytosol and in archaea. The function of GroEL is understood in great detail and the substrate interaction proteome has been recently identified. In contrast, our knowledge about the natural substrates of Group II chaperonins is deficient and as a consequence, mechanistical studies on Group II chaperonins have been limited to using the eukaryotic model substrates actin and tubulin as well as heterologous model substrates.

In the present study, the complete substrate spectrum of a Group II chaperonin, the thermosome (Ths) of the mesophilic archaeon Methanosarcina mazei (M. mazei), was analysed for the first time. In addition, the unique coexistence of both the goup I and the group II chaperonins in M. mazei, which was confirmed in the initial part of the study, provided the opportunity to obtain new insights into how the substrate selection differs between the two chaperonin groups. For these purposes, the chaperonin substrates were isolated by immunoprecipitation of the chaperonin-substrate complexes and identified by liquid chromatography coupled mass spectrometry (LC-MS) using three different approaches: LC-MS after separation of the proteins (i) by classical 2D-PAGE, (ii) by difference gel electrophoresis (Ettan DIGE) and (iii) by 1D-PAGE.

Analysis of substrates of both the thermosome (MmThs) and GroEL/GroES (MmGroEL, MmGroES) of M. mazei revealed that each chaperonin handles a defined set of substrates, and both chaperonins contribute to the folding of ~17% of the proteins in the archaeal cytosol. Bioinformatic analysis revealed that the chaperonin specificity is governed by a combination of a various physical properties (hydrophobicity, net charge and size), structural features (i.e. the domain fold), and less concrete characteristics like the evolutionary status and, in this context, the phylogenetic origin of the substrate.

Membranproteine als Mediatoren zwischen extrazellulären Reizen und intrazellulären Prozessen sind trotz ihrer enormen biologischen Bedeutung in Proteomstudien meist unterrepräsentiert. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die kartierende und quantitative Analyse des Membranproteoms am Beispiel der Modellorganismen Halobacterium salinarum und Natronomonas pharaonis.

Grundlage war die Entwicklung einer optimierten Membranisolierung für halophile Archaea unter Beibehaltung hoher Salzkonzentrationen. Nach Zellaufschluss durch Beschallen wurden die so generierten Membranvesikel über Zuckergradienten-Dichtezentrifugation aufgereinigt. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Salzkonzentrationen nicht nur zur Stabilisierung der Membran sondern auch der Membranproteinkomplexe notwendig sind. Für die Analyse von halophilen Membranproteinkomplexen wurde die Blue Native Elektrophorese-Technik etabliert und adaptiert, sodass salzhaltige Proben untersucht werden konnten. Anhand dieses Systems konnten z.T. unbekannte Proteininteraktionen nachgewiesen werden.

Da integrale Membranproteine mit der klassischen 2D-Elektrophorese nicht getrennt werden können, wurde für die zweidimensionale gelbasierte Darstellung des Membranproteoms das 16-BAC/SDS-System etabliert und bezüglich Trennleistung optimiert. Die Identifizierung von Proteinsspots war für membranassoziierte Proteine mit der peptide mass fingerprinting Methode erfolgreich, diese Technologie ist jedoch für die Analyse von integralen Membranproteinen stark eingeschränkt. Deren Inventarisierung erfolgte über einen LC-MS/MS Ansatz. Die auch bei dieser Technik beobachteten Schwierigkeiten konnten darauf zurückgeführt werden, dass Peptide, die membranintegrale Bereiche repräsentieren, spezifisch an langkettigen reversed phase Materialien verloren gehen und sich daher einer Analyse entziehen. Aus diesem Grunde war die Abreicherung membranassoziierter Proteine während der Membranisolierung durch ein mildes Detergens entscheidend, sodass integrale Proteine angereichert und der Analyse zugeführt werden konnten. Durch einen 1D-SDS PAGE LC-MS/MS Ansatz wurden so 50% des vorhergesagten integralen Membranproteoms von H. salinarum und 32% des integralen Membranproteoms von N. pharaonis identifiziert.

Damit war die Grundlage geschaffen, die Veränderungen im Membranproteom von H. salinarum, hervorgerufen durch unterschiedliches Energie- und Nahrungsangebot, zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die quantitative Membranproteomik erstmals die differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) mit dem 16-BAC/SDS-System kombiniert. Diese gelbasierte Quantifizierungsstrategie ermöglicht nicht nur eine Übersicht über das Ausmaß der Regulation des gesamten Proteoms, sondern auch die Quantifizierung einzelner Proteinspots unabhängig von deren Identifizierung.

Mit einer grundlegend anderen, massenspektrometrie-basierten Technologie wurden diese Ergebnisse verifiziert und erweitert. Theoretische Berechnungen zeigten, dass auch bei diesen Analysen die Quantifizierung integraler Membranproteine erschwert ist, da wesentlich weniger Peptide pro Protein als bei löslichen Proteinen für eine Quantifizierung zur Verfügung stehen. Sie zeigten aber auch, dass die Markierung freier Aminogruppen mit isotopenmarkierten Sonden, wie die Nicotinoylierung (ICPL), für Membranproteine erfolgreicher ist, als eine Cystein-basierte Markierungsstrategie.

Mit Hilfe der ICPL-Technologie, die in dieser Arbeit erstmals für Membranproteine angewandt wurde, war es möglich am Beispiel von aerob und phototoph kultivierten Zellen für 155 Membranproteine quantitative Information zu erhalten, darunter 101 integrale Membranproteine. Das am stärksten regulierte Protein war, wie zu erwarten, das photosynthetisch aktive Protein Bacteriorhodopsin. Daneben konnten weitere am aeroben und anaeoben Energiemetabolismus beteiligte Proteine als reguliert identifiziert werden. Die insgesamt überraschend geringen Regulationen auf Ebene des Membranproteoms

CPA is an anticancer drug that can be applied in conventional tumor

therapy, in combination with gene transfer and in antiangiogenic approaches with low

dose metronomically scheduled regimes. In the context of metronomic CPA therapy,

acrolein was shown to exhibit antiangiogenic effects and therapeutic contribution has

to be reconsidered. Despite improved treatment regimes, drug resistance will be still

an obstacle in chemotherapeutic regimes due to different escape mechanisms;

progress in the development of new strategies might be achieved by suitable in vitro

models such as the agarose overlay system or agarose wrapped microspheroids.

Die konfokale Fluoreszenzspektroskopie ermöglicht die Untersuchung der Struktur und Dynamik von Biomolekülen. In den letzten Jahren konnte sie sich zunemend im Bereich der Einzelmolekülspektroskopie etablieren, jedoch besteht gerade im Hinblick auf die zunehmende Zahl der in vivo-Anwendungen Potential, die Sensitivität und die Information, die aus einem einzelnen Datensatz herausgefiltert werden kann , zu erhöhen. In dieser Arbeit konnte die Methode der gepulsten alternierenden Anregung (Pulsed Interleaved Excitation, PIE) entwickelt werden, bei der die zusätzliche Information zugänglich ist, mit welcher Anregungsquelle das jeweilige Photon erzeugt wurde.

Die Behandlung zerstörter Gewebe- und Organstrukturen nach akuten Verletzungen oder chronischen Krankheitsverläufen hat sich zu einer enormen Belastung für das heutige Gesundheitswesen entwickelt. Neue Konzepte der Geweberekonstruktion durch Tissue Engineering führten in den letzten Jahren zu einer erheblichen Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung einer genaktivierten Fibrinmatrix zur lokalen Expression des Wachstumsfaktors epidermal growth factor (EGF). Das Konzept beinhaltet die gemeinsame Applikation autologer Keratinozyten und nicht-viraler Genvektoren mit PEI in Form einer injizierbaren Fibrinkleberzubereitung. Durch Variationen von PEI-Struktur, N/P-Ratio und dem Zusatz des abschirmenden Hüllpolymers P6YE5C wurde das Transfektionsverhalten unterschiedlicher Genvektorformulierungen in der Fibrinmatrix untersucht. Durch den Einsatz von fluoreszenzmarkierten Genvektoren wurde der Transfektionsverlauf innerhalb der Matrix visualisiert und dokumentiert. Größere Mengen ungeschützter Genvektoren führten in Fibrin trotz ihres toxischen Potentials zu hohen Genexpressionen. Ein protektiver Effekt durch den Zusatz des schützenden Hüllpolymers P6YE5C schien in Fibrin als nicht zwingend notwendig. Daraufhin wurde ein möglicher Einfluss der Fibrinmatrix auf Genvektorformulierungen untersucht. Erste Vorversuche in Zellkultur zeigten eine Steigerung des Transfektionspotentials nicht-viraler Genvektoren mit PEI nach Vorinkubation mit einer Fibrinogen-Lösung. Aus der Perspektive einer kommerziellen Anwendung heraus wurde ein lagerungsfähiges Lyophilisat aus genaktiviertem Fibrinogen entwickelt, das zum Versuchszeitpunkt als Fibrinklebervorstufe mit Wasser rehydratisiert und gemeinsam mit Thrombin zur Herstellung der genaktivierten Fibrinmatrix eingesetzt werden konnte. Der Einsatz des schützenden Hüllpolymers P6YE5C hatte dabei einen entscheidenden Einfluss auf die unmittelbare Verfügbarkeit der eingesetzten Genvektoren. Für die Regeneration von Knochenbrüchen bleibt dagegen der Einsatz medizinischer Implantate von entscheidender Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wird in einem weiteren Ansatz die Entwicklung und Charakterisierung genaktivierter Polymerfilme aus PDLLA und PLGA zur Beschichtung medizinischer Implantate beschrieben. Die neue Grenzfläche zwischen Implantat und Knochenstruktur soll zur lokalen Transfektion und Expression therapeutischer Gene dienen. Dafür wurden nicht-virale Genvektoren lyophilisiert und als Dispersion in organischen Lösungen der Polymere PDLLA und PLGA auf resistente Oberflächen aufgetragen und getrocknet. Die Besiedelung der verbliebenen Polymerfilme mit Zellen führte über den direkten Kontakt mit genaktivierten Polymerstrukturen zur Expression des eingesetzten Gens. Durch Variation von Polymer- und Genvektormenge wurde anhand der gemessenen Genexpressionen sowie der metabolischen Aktivität transfizierter Zellen das System optimiert. Die Bestimmung der Transfektionseffizienz sowie des Freisetzungsverhaltens formulierter Genvektoren diente zur Charakterisierung der genaktivierten Polymeroberflächen aus PDLLA und PLGA. Trotz struktureller Ähnlichkeiten der eingesetzten Filmbildner zeigte sich das Freisetzungsverhalten aus PDLLA gegenüber PLGA abhängig der eingesetzten Polymer- und Genvektormengen. Das Beschichtungsprinzip konnte ebenfalls für die Aktivierung von Folien aus Aluminiumlegierung eingesetzt werden und führte zur Expression des therapeutischen Gens bone morphogenic protein-2 (BMP-2). Die Verwendung von Poly-[Tyrosincarbonaten] als strukturelle Alternative zu PDLLA bzw. PLGA führte zu keiner Genexpression. Hohe medizinische Anforderungen und individuelle Interaktionen einzelner Matrixkomponenten machen genaktivierter Biomaterialien zu komplexen Applikationsformen der regenerativen Medizin. Kleinste Veränderungen im komplexen Verbund aus Matrixstrukturen, Genvektoren und Zielzellen können drastische Effekte im Gesamtsyste