萬曆二十八年（1600年）利瑪竇在南京獲得吏科給事中祝世祿的幫助，以朝貢的名義，獲得批准往北京的證件。5月18日，利瑪竇偕龐迪我神父和鍾鳴仁、游文輝兩修士及四名僕人，乘搭駐守南京的劉太監官船，啟程前往北京，郭居靜神父留在南京。利瑪竇一行人沿大運河北上，路過山東濟寧時，拜會了曾在肇慶任職的漕河總督劉東星，並再次遇到劉總督的朋友著名學者李贄。利瑪竇在南京時曾與李贄會面，李贄對利瑪竇學識淵博十分敬佩，稱讚他的品格勝過大多中國士人，他在湖廣講學時，向學生推崇利瑪竇的《交友論》；而利瑪竇稱讚李贄「極標準人也，中極玲瓏，外極樸實」。李贄是福建泉州人，別號卓吾。他公開以「異端」自居，經常發表公然挑戰傳統儒家士大夫價值觀和禮俗秩序之言論，認為當時官方所尊崇的儒家程朱理學（宋朝學者程頤、朱熹所提出的重視綱常禮教學說）是僞道學，稱道學先生為「鄙儒」、「俗儒」、「腐儒」，斥其「陽為道學，陰為富貴」。他認為表面尊崇儒學官吏，其所作所為是「不操戈矛之強盜」「吃人之老虎」。李贄主張男女自由婚姻，稱讚卓文君、紅拂女等女子之善於擇配，但又讚揚某些遵守傳統「婦德」的行為。他又主張創作必須抒發己見，從「絕假純真」之「童心」出發，反對「以多讀書，識義理障其童心」。重視小說戲曲在文學上的地位，認為《西廂記》《水滸傳》就是「古今至文」。曾評點多《水滸傳》《西廂記》等。李贄的「狂放」，在不少當權的士大夫、大臣心目中，是「敢倡亂道、惑世誣民」，加以斥逐。李贄與利瑪竇在濟寧會面之後，應朋友的邀請入京，卻被錦衣衛緝捕，投入獄中，並銷毀其著作。萬曆三十年（1602年），李贄以剃刀自刎死去。離開濟寧之後，利瑪竇一行到達天津，在天津逗留了三個月。天津官員檢查利瑪竇行李時，發現耶穌死難十字架，認為利瑪竇等人「行蠱」，欲加害皇帝，把利瑪質等投入監獄。幾經周折，萬曆皇帝得知利瑪竇等人要呈獻他一座自鳴鐘，便准許他們進京。萬曆二十九年（1601年）1月24日利瑪竇一行終於抵達北京，向皇帝呈獻自鳴鐘、西洋琴、《萬國圖志》等禮物，這年利瑪竇是49歲。然而，北京禮部只許利瑪竇等人居住在四夷館，並且認為外國國人不宜久居京城，要求皇帝驅逐離京。但奏疏留中，幾個月後，皇帝通過大太監傳話，不僅允許神父們留下，還每月發八個金幣的補貼給神父們。原因是需要神父們維修自鳴鐘。5月28日，神父們得以遷出四夷館，租貨民房居住。自此之後，利瑪竇結識了不少朝廷大臣，例如戶部尚書、武英殿大學士沈一貫，吏部左待郎兼翰林院侍讀學士馮琦，吏部尚書李戴，刑部尚書蕭大亨，光祿寺少卿李之藻等，其中李之藻成為利瑪竇重要信徒之一。據稱，李之藻開始師從利瑪竇學習西方科學。但不願信奉天主教，其後李之藻在北京突患重病，李以為必死，留下遺囑，利瑪竇「朝夕於床笫間，躬為調護」，於是皈依天主教，聖名良（Leo），將家中供祀的佛像毀棄，換上耶穌像，奉行一夫一妻，決心休離侍妾，正式受洗，與徐光啟、楊廷筠並列為「中國三大天主教柱石」之一。