Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 11/19

Development of the musculosceletal system requires coordinated formation of

distinct types of tissues, including bone, cartilage, muscle and tendon. Compared to muscle, cartilage and bone, molecular, cellular and developmental biology of tendon have not been well understood due to the lack of tendon cell lines. In addition tissue engineering of tendon is hampered by the rather difficult retrieval of tenocytes and their senescence-associated growth arrest during culture. Therefore the purpose of this study was to establish and characterize human tendon cell lines.

Two tendon cell lines (HTD2 hTERT and HTD5 hTERT) were established using

lentiviral gene transfer to ectopically express hTERT. The cell lines stably expressed hTERT on RNA and protein level. Untransduced cultured tenocytes show only a background level of telomerase activity, but it was significantly increased by hTERT transduction. Ectopic expression of hTERT led to an extended lifespan and prevented senescence while the cells kept their typical spindle-shaped morphology of young primary human tenocytes. Moreover, in comparison to untransduced tenocytes the cells possessed significantly lesser β-galactosidase activity indicating that they had not entered a senescent state. Throughout the entire culturing period the hTERT transduced tenocytes expressed tendon-related genes such as those encoding collagen I, collagen III, Tenascin C, EphA4, Eya1, scleraxis, Six and COMP. Using soft agar assay, no malignant transformation was shown by the hTERT expressing

tenocytes. In conclusion, extending the lifespan of human tenocytes by ectopic expression of hTERT using lentiviral gene transfer may be an attractive and safe way to generate cells allowing extensive molecular characterization and development of novel tissue engineering applications.

Die allogene Knochenmarks- bzw. Stammzelltransplantation wird seit den späten 70er Jahren als kurativer Behandlungsansatz bei myeloproliferativen Syndromen wie Leukämien und Lymphomen etabliert. Eine schwere und häufige (25-45%) Komplikation dieser Transplantation ist die Wirt-gegen-Spender-Erkrankung bzw. Graft-versus-Host Disease (GvHD). Die Erkrankung ist mit einer hohen Letalität von etwa 30% unter moderner Therapie verbunden und manifestiert sich häufig zunächst an der Haut.

Eine zuverlässige und rasche Diagnosesicherung ist für die Früherkennung und adäquate Therapie der GvHD entscheidend. Leider ist die akute, das heißt binnen 100 Tagen nach Transplantation auftretende GvHD (aGvHD) von akuten Arzneimittelreaktionen (AR) klinisch und histologisch schwer zu unterscheiden. Etablierte Kriterien für diese Differentialdiagnostik existieren nicht.

Die Feststellung des histologischen Schweregrads der aGvHD ist bislang eher untersucherabhängig, die des klinischen Schweregrads ist dermatologisch sehr grob und zur Verlaufskontrolle eher ungeeignet. Diese Punkte zu optimieren und einen Beitrag zur Aufklärung der Immunpathologie der aGvHD zu leisten waren die Hauptziele der vorliegenden Dissertation.

Zwanzig Patienten mit klinisch gesicherter aGvHD nach allogener Knochenmarks- oder Blutstammzelltransplantation und dreizehn Patienten mit klinisch verifizierter AR wurden in die Studie aufgenommen. Die klinischen Befunde wurden nach dem etablierten Glucksberg-Score sowie dem neu entwickelten klinischen GvHD-Schweregrad-Score (GvHSco) klassifiziert. Zusätzlich wurden Hautproben entnommen und histopathologisch sowie immunhistochemisch (Expression von CD1a, CD2, CD11c, CD20, CD25, CD34, CD68, CD197, CD206, CD207, CD 208, CD209, CD303 und S100) analysiert. Klinische und histologische Ergebnisse wurden einzeln analysiert und miteinander korreliert.

Zur besseren Beschreibung des klinischen Schweregrades der kutanen GvHD wurde der klinische GvHSco a priori entwickelt. Er bietet durch die Standardisierung und die hundertteilige Skala im Vergleich zum Glucksberg Score Vorteile bezüglich der individuellen Verlaufskontrolle.

Als histologische Schweregradkriterien korrelierten epidermotrope lymphozytäre Infiltration und Kontinuitätsverluste der Basalmembran (Epidermolyse) am deutlichsten mit dem klinischen Schweregrad.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurde auf der Basis des histologischen Scores nach Lerner durch Ergänzung des Kriteriums Epidermolyse und durch besondere Gewichtung des Kriteriums Lymphozyteninfiltration der Modifizierte Histologische Score zur Abschätzung des Schweregrads akuter GvHD (GvHiScore) entwickelt. Die Vorteile dieser modifizierten Klassifikation sind die genaue, Untersucher-unabhängige Definition und die feinere Stratifizierung der Schweregrade. So wird eine bessere inter- und intraindividuelle Differenzierbarkeit erreicht.

Als differentialdiagnostische Parameter sprachen hohe Zahlen reifer T-Zellen (CD2+, CD45RA+) und Makrophagen (CD68+), Epidermolyse, Basalzellballonierung, junktionales lymphozytäres Infiltrat differentialdiagnostisch für aGvHD, eosinophiles Infiltrat jedoch gegen eine aGvHD. Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen wurde der differentialdiagnostische Test DSHIG („Differentialdiagnostischer Score mittels Histopathologie und Immunhistochemie für akute Graft versus Host Disease“) entwickelt. Der Test errechnet sich aus der Addition sieben dichotomer Kriterien. Die retrospektive Analyse des DSHIG ergibt eine Testspezifität und -sensitivität von 95% für die Differentialdiagnose „Akute GvHD“ versus „Akutes Arzneiexanthem“. Der differentialdiagnostisch vielversprechende DSHIG sollte prospektiv validiert werden.

Bei der Lupusband-positiven akuten GvHD zeigte sich ein histologisch besonders schweres Bild mit ausgeprägter Epidermolyse. Ein Einfluss quoad vitam oder auf den klinischen Schweregrad ließ sich nicht zeigen. Die Lupusband-positiven Fälle traten bevorzugt in der späteren Phase von aGvHD auf.

Für d

Die Anzahl der Genmutationen, die mit bestimmten Erkrankungen in Verbindung gebracht werden,

steigt kontinuierlich. Um die Funktion der betroffenen Gene und daher auch die Pathomechanismen,

welche durch deren Mutationen ausgelöst werden, besser zu verstehen, werden verschiedene

Tiermodelle herangezogen. Eines dieser Tiermodelle ist der Zebrafisch (Danio rerio), der sich sehr gut

eignet, da er als Embryo oder Larve fast durchsichtig ist und bei geringen Kosten und hoher

Fekundität leicht gezüchtet und gehalten werden kann. Zudem ist sein Genom inzwischen

durchsequenziert und somit weitgehend in Datenbanken abrufbar.

KCNQ bezeichnet eine Klasse spannungsabhängiger Kaliumkanäle die evolutionär von einem

gemeinsamen Vorläufer abstammen. Beim Menschen wurden bis Februar 2010 fünf KCNQ-Gene

erforscht, die in verschiedenen Geweben unterschiedlich exprimiert werden und bei Mutationen zu

unterschiedlichen phänotypischen Erscheinungsbildern führen. So ist das KCNQ1-Gen mit dem

autosomal-dominanten Romano-Ward-Syndrom (RWS) oder dem rezessiven Jervell-Lange-Nielsen-

Syndrom (JLNS) assoziiert. Mutationen in den Genen KCNQ2 und KCNQ3 können zu benignen

familiären Neugeborenenkrämpfen führen. KCNQ2 ist außerdem mit dem Krankheitsbild der

Myokymie assoziiert. Bei Mutationen in KCNQ4 kann es im frühen Erwachsenenalter zu einer

dominanten nicht-syndromalen Form des progressiven Hörverlustes kommen, der rapide fortschreitet.

Als bisher letztes Gen der KCNQ-Familie wurde im Jahr 2000 KCNQ5 identifiziert. Bisher sind noch

keine Mutationen in diesem Gen bekannt, die mit einer Erkrankung assoziiert sind.

Der Zebrafisch wurde ausgewählt, um zu prüfen, ob sich dieser als Tiermodell für funktionelle

Untersuchungen an KCNQ-Genen und damit für die Erforschung der pathogenetischen

Zusammenhänge bei KCNQ-assoziierten Krankheiten eignet. Hierzu wurden erstmals die

verschiedenen KCNQ-Gene beim Zebrafisch identifiziert, ihre evolutionären Beziehungen zu den

menschlichen Orthologen analysiert und vergleichende Untersuchungen der Spleißvarianten

durchgeführt. Dabei wurden acht Loci erfasst, die orthologe Gene zu den humanen KCNQ-Genen

darstellen. Da es bei den Strahlenflossern in der Evolution zu einer weiteren Genomduplikation kam,

existieren von etwa achtzig Prozent der humanen Gene zwei Co-orthologe beim Zebrafisch. Im

Wesentlichen sind die orthologen KCNQ-Gene zwischen Mensch und Zebrafisch stark konserviert,

vor allem an funktionell essentiellen Bereichen.

Bei allen fünf humanen KCNQ-Genen wurden Spleißvarianten nachgewiesen. Beim Zebrafisch

konnten in vier der acht Gene Spleißvarianten gefunden werden, die mit denen der orthologen

humanen Gene weitgehend übereinstimmen.

Die durch das Online-Programm ClustalW analysierte Orthologie der KCNQ-Gene zwischen Mensch

und Zebrafisch konnte durch die konservierte Syntenie bei sieben der acht kcnq-Gene vom Zebrafisch

bestätigt werden.