Studies on the epidemiology of Canine Babesiosis in Minas Gerais, Brazil.

During two stays between April 2004 and February 2005, one in the dry season and the other during the rainy season, a total of 552 samples from 385 dogs (samples from 167 dogs were collected twice) from three different regions (Carrancas,

Carlos Chagas and Igarapé) in Minas Gerais, Brazil were collected. While the first collection only included samples from dogs living in rural areas the second collection gathered repeat samples from the dogs from the first collection as well as samples from dogs from the particular urban areas. Blood was taken from each dog and blood smears were prepared. The blood smears were microscopically analysed and the DNA, extracted from the blood, was used for Real-Time PCR analysis of infections with Babesia canis vogeli or other piroplasms. A conventional PCR for the detection of Babesia sp. was carried out. In addition an indirect immunfluorescent-antibody-test, specific for Babesia canis vogeli, was performed with all samples.

The analysis of samples from the first collection period resulted in a percentage of prevalence of 10,3 % in the Real-Time PCR and 30,0 % in the indirect immunfluorescent-antibody-test. The second collection period showed a prevalence of 8,2 % in the Real-Time PCR and 21,7 % in the indirect immunfluorescent-antibody-test. No significant difference has been found in the results from the Real-Time PCR and the origin (urban-/rural area) of the dogs in Minas Gerais, in general. However, on examining the three different regions separately, a significant difference in prevalence emerged in Carlos Chagas. In Minas Gerais there was a highly significant difference shown in the results of the indirect immunfluorescent-antibody-test. While Carrancas showed no significance at all, there was a significant difference shown in the results of Carlos Chagas and a highly significant difference shown in Igarapé. Due to the very low sensitivitiy of the microscopically analysation only two from the 552 samples were positive.

With regards to the two different time periods (dry and rainy season) in which samples where collected, no significant differences in the results of the

Real-Time PCR were recorded in Minas Gerais in general or in the various regions in particular. The results of the indirect immunfluorescent-antibody-test did not show any significance in Minas Gerais, generally, or the regions of Carrancas and Carlos Chagas in particular, whereas in Igarapé a significant difference was visible. Comparing the different age groups, a significant difference was detected in the

Real-Time PCR results and a highly significant difference in the results from the indirect immunfluorescent-antibody-test. Concerning the difference in prevalence’s of infections and antibodies based on sex (male/female) the results of the PCR showed no significant difference whereas the difference in seroprevalence was significant. The results of the hematocrit and a comparison with the positivity in the different diagnostical methods revealed no significance for the indirect immunfluorescent-antibody-test and a high significance for the Real-Time PCR. A reason for the differences in prevalences across different age groups, as compared to the results from the Real-Time PCR, could be that puppies are more prone to infections. In the results of the indirect immunfluorescent-antibody-test a higher prevalence in the older age groups points to a certain resistance of those animals after recovering from infections with B. canis vogeli. A likely cause for the differences in prevalence in the results of the Real-Time PCR and the indirect immunfluorescent-antibody-test compared to the origin (rural or urban area) of the dog samples are differences in keeping the dogs as well as a lower occurrence of the vector ticks in the urban areas.

In der CA1 Region des Hippocampus von Mäusen existieren zwei funktionell und morphologisch unterschiedliche Arten von Astrozyten, die aufgrund des Besatzes mit Glutamat-Rezeptoren bzw. Glutamat-Transportern als GluR- und GluT-Zellen bezeichnet werden (Matthias et al., 2003).

In der vorliegenden Arbeit wurden die Astrozyten der CA1-Region des humanen Hippocampus von Patienten mit TLE und die Astrozyten der SGZ des Gyrus dentatus in einem Maus Epilepsie-Modell untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass auch im humanen Hippocampus zwei Gruppen von Astrozyten existieren, die offensichtlich ähnliche funktionelle und morphologische Eigenschaften besitzen wie die GluR- und GluT-Zellen im Hippocampus von Mäusen. Bei einer der zwei untersuchten Patientengruppen, den Patienten mit AHS, kommt es jedoch krankheitsbedingt zum nahezu vollständigen Verlust der GluT-Zellen und damit verbunden zu massiven Veränderungen in der Kalium- und Glutamatpufferkapazität. Darüberhinaus konnte durch Transkript-Analysen gezeigt werden, dass es bei den verbliebenen GluR-Zellen dieser Patienten zu Veränderungen im Flip/Flop-Spleiß-Verhältnis der GluR1-Untereinheit kommt. Hierbei ist der relative Anteil von GluR1 in der Flip Version erhöht. Diese Veränderungen tragen zur Genese und/oder Ausbreitung von Anfallsaktivität bei. In der SGZ des Gyrus dentatus von Mäusen findet man, im Gegensatz zur CA1-Region, mindestens drei unterschiedliche Typen von Astrozyten. Zum einen gibt es als „radiale“ Glia bezeichnete Zellen, die einen langen, in die Körnerzellschicht reichenden Fortsatz haben. Das Strommuster und die Glutamat-Sensitivität dieser Zellen entspricht dem der GluT-Zellen in der CA1 Region. Zusätzlich findet man Zellen mit der Morphologie von GluR-Zellen, von denen aber nur ein Teil auch das Strommuster von GluR-Zellen besitzt. Die übrigen Zellen sind durch das Fehlen einzelner Stromkomponenten gekennzeichnet. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Astrozyten keine einheitliche Zellpopulation darstellen, sondern, dass regional unterschiedlich, verschiedene Gruppen von Astrozyten existieren. Dies konnte nicht nur im Hippocampus von Mäusen, sondern auch im humanen Hippocampus gezeigt werden, wo es krankheitsbedingt bei einer bestimmten Form der TLE zu Veränderungen der Zusammensetzung der Astrozytenpopulationen und zu Veränderungen an Glutamat-Rezeptoren kommt.

A short-term (24 h) culture system for bovine oviduct epithelial cells (BOEC) suitable for co-culture experiments with embryos was established and evaluated. BOEC were obtained on Day 3.5 of the estrous cycle and processed by mechanical means only to obtain cell aggregates. Cell yields were 10-fold higher as described in former studies employing enzymatic treatment to achieve a single cell suspension for seeding to obtain a BOEC monolayer.

Light microscopic examinations showed vigorously beating cilia on the apical side of the BOEC in aggregates and a rapid and constant motion of cell aggregates due to active ciliary beat. Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy confirmed ultrastructural characteristics of BOEC at seeding and after 24 h in culture very similar to the situation in vivo. Both secretory cells with numerous secretory granules and ciliated cells with long, well-developed kinocilia were visible. The purity of the epithelial cell culture was > 95 %, as assessed by immunocytochemical methods.

For further characterization of cultured BOEC, gene expression patterns were examined after different time spans in culture. Cultured BOEC isolated from ampullae ipsilateral to the ovulation site yielded significantly higher amounts of RNA than their contralateral counterparts (2.73 ± 0.98 versus 2.31 ± 0.14 µg per 10^6 cells). However, quantitative PCR did not detect significant differences in transcript levels between ipsi- and contralateral BOEC for the majority of marker genes (ESR1, ESR2, HMGCR, OVGP1, PGR, TRA1) throughout the 24 h culture period. The analysis of combined data obtained from different sampling time points during the culture period revealed an effect only for GPX4 (B. taurus non-selenium glutathione phospholipid hydroperoxide peroxidase), a gene known to be differentially expressed in vivo. Marker gene expression of five genes remained stable after 6h of cell culture, indicating only a short adaptation period of cultured cells. The use of two different sera (estrous cow serum versus cow serum obtained on Day 3.5 of the estrous cycle) in a concentration of 2 % did not affect gene expression patterns.

Western blot analysis confirmed ESR1 (estrogen receptor α) and PGR (progesterone receptor) protein expression throughout the culture period. In agreement with cyclic differences in vivo, stimulation with 10 pg/ml estradiol-17β increased PGR transcript abundance in BOEC significantly. A response to the stimulation with 10 ng/ml progesterone was shown as INOS (inducible nitric oxide synthase) gene expression increased significantly after steroid treatment.

Thus, the developed culture system provides functional BOEC with an unchanged morphology and maintained functionality as compared with cells in vivo. The system is rapidly available for use in co-culture experiments with bovine embryos and provides cultured cells in sufficient quantities for holistic transcriptome and proteome studies, thereby helping to decipher early embryo-maternal communication.

Untersuchungen strahleninduzierter Änderungen der Proliferation und des Zelltodes stellen Schwerpunkte der radiobiologischen Forschung dar. Aus strahlentherapeutischer Sicht interessieren hier im Besonderen die in Tumoren nach Strahlenexposition zu findenden Genexpressionsänderungen, die assoziiert mit strahleninduzierten Änderungen der Proliferation und des Zelltods auftreten. Detaillierte Kenntnisse der diesen biologischen Prozessen zugrundeliegenden Änderungen auf Genexpressionsebene könnten dazu beitragen, die Effizienz der Strahlentherapie humaner und tierischer Tumoren zu verbessern.

So ist eine große Anzahl an für Proliferation und Apoptose kodierenden Genen bekannt. Es sind bisher jedoch nicht alle an der Proliferationskontrolle beteiligten Gene gefunden worden. Ebenso wird postuliert, dass auch andere Formen des Zelltodes als Apoptose auf Genexpressionsebene reguliert werden. Deshalb wurde mithilfe eines Mikroarrays mit 11.835 Genen ein Screening nach differentiell exprimierten Genen an strahlenexponierten A549 Zellen (humanen Lungenkarzinomzellen) vorgenommen. Hierzu wurden die Zellen synchronisiert, in der S-Phase mit 5 Gy bestrahlt und an den Zeitpunkten, die der Ausbildung des G2-Blocks und dem Anstieg mikrokernhaltiger und abnormaler Zellen zeitlich vorausgingen, das Screening durchgeführt. Die geeigneten Zeitpunkte wurden zuvor anhand durchflusszytometrischer Zellzyklusuntersuchungen und der Messung des Zelltodes (MAA-Assay) bestimmt.

Die hybridisierten Mikroarrays wurden nach dem Digitalisieren unter Zuhilfenahme einer geeigneten Software interaktiv ausgewertet. Es konnten maximal 987 exprimierte Gene gefunden werden, was 12 % aller Gene des Mikroarrays entsprach. Setzte man die Genexpression der mit 5 Gy bestrahlten Zellen ins Verhältnis zu der Kontrolle, konnten 101 Gene als differentiell exprimiert ermittelt werden. Die Anzahl der herunterregulierten differentiell exprimierten Gene übertraf die Anzahl der hochregulierten differentiell exprimierten Gene zu jedem gemessenen Zeitpunkt immer ca. um den Faktor 4. Des Weiteren wurden die differentiellen Genexpressionen relativ zur Kontrolle der unterschiedlichen Zeitpunkte miteinander verglichen, wobei eine auffällige homogene Herunterregulation der Gene festzustellen war. Nach Einteilung der differentiell exprimierten Gene in funktionelle Gruppen konnten viele Gene, die für den Aufbau des Zytoskeletts kodierten, ermittelt werden. Hierbei standen im Vordergrund vor allem Gene für Tubulinproteine und Aktin. Des Weiteren konnten 8 Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, identifiziert werden. Der Anteil bekannter, die Proliferation ("cyclin-dependent kinase inhibitor 1A" (p21, Cip1), "prothymosin, alpha") bzw. die Apoptose ("Caplain" und "TNF receptor-associated factor 1", "Caspase recruitment domain protein 14") regulierender Gene war gering. In Übereinstimmung mit zuvor durchgeführten Untersuchungen in anderen in vitro Modellen konnte eine aktive Herunterregulation bestimmter biologischer Funktionen (z.B. Zytoskelett, Proteinbiosynthese) bei gleichzeitiger Inhibition anderer Funktionen (Proliferation)gezeigt werden ("active silencing").

Da die Aussagen des Mikroarrays nur semiquantitativ sind, müssen die Ergebnisse noch durch ein quantitatives Verfahren (RTQ-PCR) validiert und ergänzt werden.

Die vorläufigen Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise darauf, dass neben den bekannten Zellproliferation und Zelltod kodierenden Genen in einem erheblichen Maß auch andere funktionelle Gengruppen wie z.B. Zytoskelett- und ribosomale Proteine kodierende Gene beteiligt sind und die Zelle im Sinne eines "active silencings" durch Abschalten verschiedener Zellfunktionen ihren eigenen Untergang vorbereitet.

Ziel dieser CT-osteoabsorptiometrischen Studie war es, die vorherrschende Belastungssituation in Kniegelenken von lebenden Hunden mit Ruptur des vorderen Kreuzbandes (KBR) sowie von lebenden Hunden mit medialer Patellaluxation darzustellen. Insgesamt wurden 29 Patienten untersucht; 17 mit KBR sowie 12 mit Patellaluxation nach medial. Diesen beiden Patientengruppen wurde jeweils eine Kontrollgruppe (n= 21) gegenübergestellt. Die Unterteilung der Kontrollgruppen kniegesunder Tiere erfolgte anhand der typischen Charakteristika der beiden Patientengruppen in eine Gruppe großer (n = 11), d.h mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 32 kg, sowie in eine Gruppe kleiner Hunde (n = 10), d.h. einem durchschnittlichen Körpergewicht von 7 kg. Allerdings konnte zur Datenerhebung für die Kontrollgruppen nicht auf lebende Tiere zurückgegriffen werden, sondern es wurden die Kniegelenke toter Tiere untersucht. Als „gesund“ wurden Kniegelenke definiert, die makroskopisch keine Knorpelveränderungen bzw. -läsionen aufwiesen.

Zur Auswahl der Patienten wurden die Ergebnisse der klinischen und radiologischen Untersuchung herangezogen, die in der darauffolgenden kurativen Operation bestätigt wurden.

Bei der Ausführung der Computertomographie wurde standardisiert vorgegangen. Die CT-Osteoabsorptiometrie erfolgte nach der von Müller-Gerbl (1991, 1998) entwickelten Methode. Aus den Dichteverteilungsmuster sollten Rückschlüsse auf die Beanspruchung im Gelenk gezogen werden. Die Beanspruchung hängt von der Geometrie der Gelenkkörper sowie von der Größe und Richtung der auf sie einwirkenden Kräfte ab.

In den Kontrollgruppen finden sich regelmäßige Verteilungsmuster für alle drei Knochen des Kniegelenkes. Auch stimmten die Ergebnisse beider Kontrollgruppen überein, sodass eine zusammenfassende Betrachtung möglich war. An der Tibia lag der Bereich höchster Beanspruchung zentral auf der Gelenkfläche, sowohl am medialen als auch am lateralen Tibiakondylus. Auch an der Trochlea ossis femoris fand sich der Bereich höchster Beanspruchung mittig im Sulcus trochlearis, mit einer Längsausdehnung von proximal nach distal. Auf den Femurkondylen wiederum zog sich der Bereich längs über die Kondylen. Die Patella hat ebenfalls zentral auf ihrer Gelenkfläche den Bereich höchster Beanspruchung.

Die kranken Gliedmaßen der Hunde mit KBR zeigten eine an allen Gelenkabschnitten niedrigere Mineralisierung als in den Kontrollgruppen. Aber auch die vermeintlich gesunde Gliedmaße blieb unter den Werten der Kontrollgruppe. Das aussagekräftigste Ergebnis findet sich bei dieser Patientengruppe an der Tibia. Hier verschob sich das Dichtemaximum nach kaudal, sowohl am medialen als auch am lateralen Kondylus. Auch auf den kontralateralen Kniegelenken entsprach das Dichtemuster der Tibia nicht dem gesunder Tiere.

Als typischste Veränderung bei Patienten mit Patellaluxation nach medial ist die Verschiebung des Dichtemaximums nach medial auf der Trochlea ossis femoris und die Verkürzung des Maximums in proximo-distaler Richtung zu nennen. Hinsichtlich der Mineralisierung ließ sich in dieser Patientengruppe zwischen akuter und kontralateraler Gliedmaße kein signifikanter Unterschied feststellen. Die Werte blieben aber deutlich unter denen gesunder Tiere.

Sekundäre Messdaten ergaben, dass in gesunden Kniegelenken der mediale Anteil des Tibiaplateaus die höchste Mineralisierung aufweist, gefolgt von lateralem Tibiakondylus, Patella, Femurkondylen und Trochlea ossis femoris. In der KBR-Patientengruppe wie auch in der Patientengruppe mit medialer Patellaluxation findet sich diese Hierarchie wieder.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hauptbelastung im Kniegelenk auf den Tibiakondylen liegt. Charakteristische Verteilungsmuster spiegeln sowohl bei Gelenken mit KBR als auch bei solchen mit Patellaluxation nach medial die gestörte Biomechanik wider. Auch die kontralateralen klinisch unauffälligen Kniegelenke der Patienten lassen Abweichungen der Dichtemuster von der Norm und somit eine gestör

Die cGMP-abhängige Proteinkinase (cGKI) vermittelt den relaxierenden Effekt der NO/cGMP Signalkaskade im glatten Muskel. Die Phosphorylierung des IP3-Rezeptor assoziierten cGMP-Kinase Substrats (IRAG) ist ein Prozess, der in diesem Mechanismus involviert ist. Um dieses Modell genauer zu verifizieren, wurde die cGMP-abhängige Relaxation in Mäusen, die ein modifiziertes IRAG expremieren, untersucht. Bei der IRAGD12/D12 Maus handelt es sich um eine Deletionsmutante, bei der die Interaktionsstelle von IRAG mit dem IP3-Rezeptor Typ I zerstört wurde, was dazu führt, dass IRAG nicht mit dem IP3-Rezeptor Typ I interagieren kann. Diese Mäuse zeigen eine normale Futteraufnahme, der Kotabsatz ist aber signifikant geringer als bei Wildtypmäusen.

Eine Röntgenkontrastuntersuchung mit Hilfe von Bariumsulfat offenbarte eine deutliche Verlängerung der Darmpassagezeit, einen Megaoesophagus sowie ein Megacolon. In situ-Erhebungen an der eröffneten Bauchhöhle bestätigen diese Befunde. Gründe für diese Veränderungen könnten Funktionsstörungen in der glatten Muskulatur sein. Zur Stützung dieser Vermutung wurden die cGMP-abhängigen Effekte an der glatten Muskulatur des Darmtraktes untersucht.

Die Untersuchung des Hormon induzierten Tonus im Jejunum ergab keinen signifikanten Unterschied in der cGMP-Wirkung zwischen den Wildtyp- und den IRAGD12/D12 Mäusen. Der CCh induzierte Tonus im Colon der Wildtypmäuse wird im Gegensatz zu den IRAGD12/D12 Mäusen durch 8 Br- cGMP um ca. 90% reduziert. Bei den IRAGD12/D12 Mäusen bewirkt 8 Br cGMP nur eine sehr geringe Relaxation (16%) des Hormon induzierten Tonus am Längsmuskel des Colons.

Eine Vorinkubation mit dem Phosphatase-Hemmstoff Calyculin A in Präparaten von Wildtypmäusen hebt den relaxierenden Effekt von 8-Br-cGMP im glatten Muskel des Dünndarms auf, im glatten Muskel des Colons findet dagegen keine Aufhebung statt.

Die Ergebnisse zeigen, dass IRAG eine entscheidende Bedeutung für die cGMP/cGKI-vermittelte Relaxation im Colon, aber nicht im Jejunum hat. Eine cGMP/cGKI-vermittelte Aktivierung einer Phosphatase kann als möglicher Mechanismus der cGMP abhängigen Relaxation im Jejunum in Frage kommen. Eine mögliche Phosphatase könnte hierbei die Myosin leichte Ketten Phosphatase (MLCP) sein.

Es ist aber nach wie vor unklar, ob diese Ergebnisse Grund für die geringe Lebenserwartung der IRAGD12/D12 Mäuse sind. Um die Ursachen dafür zweifelsfrei feststellen zu können, bedarf es weiterführender Untersuchungen.

Efficacy of Echinacea-Supplemented Feeding on Health and Immune Status

of Horses

Phytotherapeutic medication with immunemodulatory efficacy represent one possible alternative to general bactericidal or anti-inflammatory agents. The genus Echinacea with its more than 300 phytotherapeutic or homeopathic preparations takes up a significant part of the phytotherapeutic medication segment. It is already well-established as a feeding supplement for horses. The aim of this study is to examine whether a 2.5 percent supplement of Echinacea Purpurea (Purple Coneflower) in the day to day feeding of healthy horses has no adverse affects but may rather have a positive effect on the level of stress, the general health condition as well as the immune system.

The placebo-controlled double blind study included 37 horses. Aerial plant parts of E.

purpurea were added to the feeding ration in the form of pellets over a period of 35 days. The dosage made up 2.5 percent of the estimated average daily dry matter intake based on sustenance requirements of 2 kg TS/100 kg LM. General well-being, blood results, the plasma cortisol concentration as well as the serum concentration of immune globuline G were determined on Day 0, 10, 21, 28, 35, and 70. The respiratory burst activity of granulocytes was measured as well as the plasma’s anti-oxidative potential. An anti-rabies vaccination was used to detect a possible influence on the development of vaccine titer.

General well-being and health condition of the included horses rated good throughout the

examinations conducted in the course of the study. The statistically evaluated parameters

respiration, temperature, pulse, and digestion showed no significant fluctuations within or between comparison and control groups, which would suggest a positive or negative impact of the Echinacea feeding supplement. For lack of difference between groups an influence of Echinacea on plasma cortisol concentrations may also be ruled out. The granulocytes’ respiratory burst activity was determined on Days 0, 21, and 35 for ten horses at a time from the Echinacea-group as well as the control group. In the course of the experiment a decline of

the Median Fluorescence Intensity was observed. Still, a causal connection to the Echinaceasupplement could not be concluded, because tests showed no significant differences between the Echinacea-group and the control group. The plasma’s anti-oxidative capacity was

determined on Days 0, 10, and 28. In the course of the experiment, values increased in the Echinacea-group as well as the control group. No significant difference was detected between the groups. Determination of immuneglobuline G fostered serum results between 17.15 mg/ml and 26.82 mg/ml. During the experiment, there was a decline in IgG-concentrations after Day 0. In the control group this became visible from the second blood sample on. In the Echinacea-group, this became visible only in the fourth and subsequent blood samples. There were however no significant differences between groups. The anti-rabies vaccination was administered on Day 21. The titer was determined on Day 21 and Day 35. Titer development did not differ between Echinacea-group and control group. A separate consideration of first and refresh vaccinations did not yield significant differences between groups either.

Concluding from the results of this study, feeding supplemented with 2.5 percent E. purpurea has no adverse affects on healthy horses. However, there also is no positive influence on the condition of health and immune system to be expected. It was not possible to determine a positive or negative influence of Echinacea-supplemented feeding on any of the discussed parameters under this test conditions (typical horse keeping conditions, placebo-controlled

double blind study).

Epidemiological studies on Viral Haemorrhagic Septicaemia (VHS) and Infectious Haematopoietic Necrosis (IHN) in the Southwest of Germany

The purpose of this thesis has been to research the epidemiological importance of virus emission from fish farms infected by Viral Haemorrhagic Septicaemia (VHS) or Infectious Haematopoietic Necrosis (IHN). In a field experiment rainbow trout were encaged 640 m below a VHS-infected farm. The rainbow trout were infected by the virus identical to the farm isolate. In an other watercourse IHN-Virus was isolated from experimental rainbow trout in water cages 650 m downstream a fish processing plant, which was regularly supplied with infected fish. In an endemic stream the transmission of VHS-Virus to experimental encaged trout succeeded, presumably through wild brook trout (Salmo trutta f. fario), 220 m upstream the discharge position of an VHS-infected fish farm.

In the course of eradication of VHS-Infection in a large fish farm, the supplying brook was completely electrically fished in the late summer. A specific VHSV gene sequence could only be detected by means of RT-PCR in feral rainbow trout.

By sequencing the virus isolates it was possible to demonstrate mutations of VHSV in infected farms and the connected watercourse-system.

Furthermore, during the spawning-fishery epidemiological studies, 300 sexually mature white fish (Coregonus lavaretus), as well as on further organ samples of fished white fish (Coregonus spp.), lake trout (Salmo trutta f. lacustris), pike (Esox lucius) and arctic charr (Salvelinus alpinus) from Lake Constance were virologically examined. Neither VHSV nor IHNV were detected.

Rainbow trout fingerlings were exposed to cleaned and oxygenated sewage effluent for 62 days. Potential infectious waste water from slaughtering of the above-mentioned fish processing plant was introduced to the sewage plant. VHSV or IHNV obviously do not endure the three-stage sewage treatment in infectious condition.