概要：Ep 7に引き続き小林さん(NAIST)をゲストに迎え、motif graftingによるADP/ATP結合タンパク質のde novoデザインのHands-onを行いました。

ゲスト：小林直也 先生

2024. 5. 29. 収録

概要：10年以上に渡りde novoタンパク質デザインに携わり、現在は奈良先端科学技術大学院大学 (NAIST)廣田研究室で助教をされている小林直也さんをゲストにお招きし、de novoタンパク質の歴史と共に歩んできたキャリアについて伺いました。

[00:00:00] 雑談

[00:10:50] ゲスト紹介

[00:11:21] デザインとの関わり - pre-RosettaからRosetta

[00:32:02] 新井研〜古賀研

[00:37:06] 高校〜大学時代

[00:56:11] カーボンナノチューブを分散させる話

[01:06:45] de novo二量体タンパク質を単量体/ファイバーにする話

[01:14:42] 配列空間を広げずに構造空間を広げたい話

[1:39:39] 古賀研研究員時代

概要

[00:00:00] 雑談

[00:06:53] 論文概要

[00:13:48] Figure1 論文コンセプトとPoC実験

[00:41:10] Figure2 CHAMPとmEpoRの結合トポロジー

[00:47:23] Figure3 CHAMPの発現量のコントロール

[00:53:57] Figure4 CHAMPあるいはEpoRへの変異導入による重要な残基の検証　

[00:57:27] Figure5 NMRによるCHAMPとEpoRの結合部位の検証

[01:02:33] Figure6 ケミカルシフトの周期性

概要：理研BDRでチームリーダーとして研究室を主宰されている新津藍さんをお招きし、ペプチド化学と分子動力学の二刀流スタイルに至った経緯と膜タンパク質デザインの今後の展望についてお聞きしました

[00:00:00] ゲスト紹介

[00:03:23] 学生時代@東大

[00:14:00] ポスドク@Bristol

[00:41:23] ポスドク@理研

[01:01:40] PI@理研

概要　Ep 2に引き続き、濱田さん(東工大)をゲスト迎え、DNA結合タンパク質のデザインに関するBioRxivプレプリントを読みました。Computational design of sequence-specific DNA-binding proteins

(00:00:00) 雑談

• ゲスト : 濵田 省吾 先生研究室HP、Xアカウント
• Ep2であがった、DNAをタンパク質クリップで止めた論文　TAL protein + DNA, 2017 Science

(00:02:42) Abstract

• LacO, LacI Kd (10 pM in vitro, 10 nM in vivo) https://academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gkz698

(00:06:17) Introduction

• DNA結合タンパク質の設計の難しい点

(00:11:07) Fig1 Scaffoldライブラリーの作製

• 自然界を参考に主鎖骨格ライブラリーを作製HTH（Helix-turn-helix）https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15808743/ DNA結合タンパク質によく見られる、αヘリックス３つで三角形を組んだようなモチーフ
• RSMD (root-mean-square deviation) ２つタンパク質の間で原子位置の変位の二乗平均平方根を取って類似性を比較
• LDDT CASP9で導入された構造類似度指標、局所的な類似性を重視
• pLDDT LDDTの予測値としてAlphaFold2開発過程で開発された指標。値が高いほど予測のconfidenceが高いとみなせる https://alphafold.ebi.ac.uk/faq
• TM-score (template modeling score) CASP5 から導入された構造類似度指標、RMSDがアミノ酸長に依存してしまう点など改善
• Data Distillation ある機械学習のモデルに対し、正解ラベルがついていないデータ(をさまざまな形でtransformしたもの)を入力としてサンプリングし、出力を平均化してモデルのトレーニングに用いることでパフォーマンスを向上させる技術
• CASP (Critical Assessment of protein Structure Prediction) タンパク質配列からの構造予測技術の向上を目指す国際的実験。2年に1回、構造未発表のタンパク質を使ってさまざまな手法が横並びでベンチマーキングされる

(00:22:41) 塩基と結合しうるアミノ酸の配向パターンのライブラリーを作製し、それを満たすHTH Scaffoldを選抜し、さらに多様化する

• RIFgen, RIFdock 結合対象の分子に相互作用しうるアミノ酸の種類と配向を、主鎖構造を度外視して洗い出したうえで、タンパク質形状として成り立つアミノ酸セットを抽出する設計手法
• Rosetta
• ProteinMPNN, LigandMPNN Message-Passing Neural Network (MPNN) という機械学習手法を用いた、主鎖構造からのタンパク質配列デザイン手法. Ligand MPNN で小分子にも拡張
• Rosetta Rotamer Boltzmann calculation 側鎖のロータマーのボルツマン分布を算出. DNA結合前からpre-organizedされたアミノ酸とrotamerを選びエントロピーロスを抑える
• MotifGraft 既存の構造モチーフを基に新しいタンパク質をデザインする手法. Rosetta の機能
• RFDesign RosettaFoldをベースとするタンパク質デザインsuite。ただし現在はほぼ使われず、RFDiffusionが取って代わっている。InpaintingはRFDesignに含まれる手法の一つ。任意の構造モチーフを入力として、残りの構造を補完するようなタンパク質構造を生成する手法 (モチーフスキャフォールディング)
• 実際に試した配列デザイン→多様化の流れ3パターン(4万種類以上) ①Rosetta FastDesign→MotifGraft, ②LigandMPNN→MotifGraft, ③LigandMPNN→Inpainting
• 収録後Cameron さんからのコメント Q. 各デザイン手法間で成功率に違いはあったか A. 成功率の定義によるが、RIFgen-RIFdock-LigandMPNNがタンパク質のbehavior (=solubleに発現精製できるか)という意味でも結合の特異性という意味でも一番成功率が高かった

(00:40:05) FigS5 Yeastを使ったsurface displayでのデザインの絞り込み

• Yeast display 酵母の細胞表面にタンパク質を発現し、結合能などでスクリーニング
• Deep sequencing 次世代シーケンサーによって一分子レベルでDNA配列を解析すること。本来は同じゲノム領域を”多重”に読み、希少多型を検出できることから deep。

(00:44:01) Fig2 DBPが認識するDNA配列の特異性とDBPの構造

• BLI (bi-layer interferometory) 分子間相互作用を光の位相変化で検出、SPRがフローセルなのに対し、BLIはプローブなので粘度のある細胞抽出液や、96穴などの解放系で直接測定可能

(00:50:20) Fig3 DBPとDNAの複合体の結晶構造、DBPへの変異導入が及ぼす影響

• Fig 3C 実際のDNAの構造が歪んでいたせいでデザインとは違った様式で結合していた
• B-DNA : A型、B型、Z型とある中で最も一般的なDNA構造. 右巻き1回転あたり塩基数10、塩基対間距離3.4 Å、らせんの直径20 Å、湿度92%時にとる立体構造。https://ja.wikipedia.org/wiki/二重らせん
• Saturation mutagenesis : あるアミノ酸残基を20種類のアミノ酸へとランダムに置換すること
• 収録後Cameron さんからのコメント Q. ターゲットとするDNA配列はどうやって選んだか？ A. 基本的にランダムに生成した配列。あくまで具体的なアプリケーションというより任意の配列のDNAに結合するタンパク質をデザインする方法論の開発に主眼を置いたから

(00:58:18) Fig4 DBPの直交性の確認=他のDNA配列にくっつかないか確認

• universal protein binding microarrays (uPBMs) 7塩基のDNA配列の全パターン（=4^7）を含むマイクロアレイ上でDBPの結合をテスト

(01:01:08) Fig5 細胞の中でDBPが転写をコントロールするのに使えるか？

• DBP1個では機能せず, DBPを2個つないでテスト (Fig S16)2量体化には TetR や RFdiffusion (homo dimer や hetero dimer) を利用
• YFP (Yellow Fluorescent Protein)
• TetR (Tetリプレッサー)
• Ep2で触れたCID (Chemically induced dimerization)デザイン論文2024, BioRxiv
• ENGRAM 転写活性化による guide RNA の発現を Prime Editor (逆転写酵素を融合したCas9 Nicase）でゲノム上のバーコードに記録

(01:11:10) Discussion, Closing 

概要

リリースされたばかりのAlphaFold 3について新津さん(理研)を交えて、本田、松林、岡本で雑談しました。(Disclamer: policyやtermsについてはAlphafold 3のサイトで確認してください)

Show notes

(参考・タンパク質構造予測全原子モデル開発の時系列)

0:00:00~ トピック/雑談

0:06:13~ 濱田さん登場

0:14:00~ DNAナノテク黎明期

0:27:14~ 学生時代 (T-motif)

0:34:02~ 助教・コーネル大留学 (DNA gel)

0:44:20~ 現在の研究 (DNA gel-based system)

1:03:00~ 会社と研究室紹介

岡本、本田、松林で”Papers for protein design using DL”, RFAA/RFDiffusion-AA, PyMOL3 などについて話しました。

Show Notes

岡本（東北大 学際研）、本田（ワシントン大 IPD）、松林（東北大 学際研）で podcast を始めるにあたっての経緯、意気込み、今後の予定などについて話しました。

Show Notes

パーソナリティ自己紹介

ポッドキャストのきっかけ

ポッドキャストの予定コンテンツ