Die diabetische Nephropathie ist derzeit weltweit der häufigste Grund für die terminale Niereninsuffizienz mit einem Anteil von einem Drittel aller Fälle. Im Verlauf der diabetischen Nephropathie kommt es zu einer zunehmenden Glomerulosklerose. Die Fähigkeit der parietalen Epithelzelle zur Ausbildung von extrazellulärer Matrix und ein möglicher Beitrag zur Glomerulosklerose ist bislang unklar. Daher sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle bei der diabetischen Nephropathie vermehrt extrazelluläre Matrix bildet und dadurch die Bowman’sche Kapsel verdickt. Diese Frage wurde unter Verwendung einer immortalisierten murinen parietalen Epithelzelllinie und einer primären humanen parietalen Epithelzelllinie im Zellversuch und Stimulation dieser Zellen mit hoher Glukosekonzentration (30mM), TGF-β1 und „advanced glycation endproducts“ nachgegangen. Außerdem wurde retrospektiv die Bowman’sche Kapsel von sechs humanen Nierenbiopsien mit diabetischer Nephropathie per Licht- und Transmissionselektronen-mikroskopie untersucht.

Im ersten Schritt war die Aktivierung der parietalen Epithelzelle unter diabetischer Kondition Fokus der experimentellen Untersuchung. Hier lag ein zellspezifischer Effekt vor. Während für die humanen parietalen Epithelzellen keine funktionellen oder morphologischen Zeichen der Aktivierung gefunden werden konnte, zeigten murine parietale Epithelzellen eine Aktivierung nach Stimulation mit TGF-β1. Der zweite Schritt bestand in der Untersuchung der Bildung von TGF-β1 in parietalen Epithelzellen. Auch hier konnten unterschiedliche Stimulationseffekte bei den murinen und humanen parietalen Epithelzellen beobachtet werden. Während die humanen parietalen Epithelzellen weder auf Transkriptions-, noch auf Translationsebene eine geänderte Expression zeigten, exprimierten die murinen parietalen Epithelzellen in einem positiven Feedback-Mechanismus auf Transkriptionsebene verstärkt TGF-β1 nach Stimulation mit TGF-β1. Auf Translationsebene konnte eine verstärkte Bildung von TGF-β1 nach Stimulation mit „advanced glycation endproducts“ und eine verminderte Bildung nach Stimulation mit Glukose beobachtet werden. Der dritte Schritt beinhaltete die Untersuchung der Kollagenbildung in den parietalen Epithelzellen und die Vermessung der Bowman’schen Kapsel. Während Glukose in keiner der Zelltypen zu einer Änderung der Kollagengenexpression führte, induzierte TGF-β1 in den humanen und murinen parietalen Epithelzellen eine Hochregulation der Genexpression verschiedener Ketten von Kollagen IV und Kollagen I α 1. „Advanced glycation endproducts“ verstärkten die Transkription der Kollagene in den humanen parietalen Epithelzellen, wohingegen sie diese in murinen parietalen Epithelzellen herunterregulierten. In der retrospektiven histologischen Untersuchung von sechs Patienten mit diabetischer Nephropathie und sechs Vergleichspatienten wurde per Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie die Dicke der Bowman’schen Kapsel vermessen. In den lichtmikroskopischen Messungen zeigte sich für die Patienten mit diabetischer Nephropathie eine signifikant verdickte Bowman’schen Kapsel. Diese Verdickung konnte bei Patienten mit diabetischer Nephropathie in den transmissionselektronenmikroskopischen Messungen bestätigt werden. Letztlich ist die Lichtmikroskopie die geeignetere Messmethode, weil hier eine höhere Anzahl an Glomeruli gemessen werden kann und sie einen Selektionsbias ausschließt.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle unter diabetischer Kondition verstärkt extrazelluläre Matrix bildet und diese basal ablagert. In den murinen parietalen Epithelzellen ergaben sich Hinweise auf den Mechanismus der Aktivierung und einen positiven Feedbackmechanismus von TGF-β1 bei der diabetischen Nephropathie. Die Verdickung der Bowman’schen Kapsel ist von klinischer und diagnostischer Bedeutung, da die Ausbildung der parietalen Fibrose viele Funktionen der parietalen Epithelzellen und Bowman’sch

The genus Legionella consists of environmental bacteria which are the causative agents of

the severe pneumonia Legionnaires’ disease. L. longbeachae and L. pneumophila are able

to replicate intracellularly in human alveolar macrophages and aquatic or soil amoebae. In

order to replicate within host cells the bacteria establish a compartment derived from the

endoplasmatic reticulum (ER) which is called “Legionella-containing vacuole” (LCV). A

bacterial intracellular multiplication/defective in organelle transport (Icm/Dot) type IV

secretion system (T4SS) is essential for the formation of this LCV. The Icm/Dot T4SS

enables translocation of effector proteins into the host cell. More than 100 effector proteins

are presumably translocated during an L. longbeachae infection whereas around 300

translocated effector proteins are known for L. pneumophila. During maturation the LCV

communicates with vesicles from the endocytic vesicle trafficking pathway, avoids fusion

with lysosomes and instead fuses with the ER. Phosphoinositides (PI) such as

phosphatitdylinositol-4-phosphate (PtdIns(4)P) are enriched on the LCV which mediate

the binding of Icm/Dot translocated effector proteins like SidCLpn (substrate of Icm/Dot

transporter) as well as its paralogous protein SdcALpn.

The 73 kDa effector SidM but not the 106 kDa SidCLpn was found in a previous

phosphoinositide pulldown assay with L. pneumophila lysate to be the major PtdIns(4)P

binding protein. Using L. longbeachae lysate we showed binding of the 111 kDa SidCLlo to

PtdIns(4)P in a phosphoinositide pulldown. This result was confirmed by protein-lipid

overlay assays using “PIP-strips”. In further analysis the P4C (PtdIns(4)P-binding of SidC)

domain was identified as a 19 kDa domain of SidCLlo located in the amino acid region 609

to 782. This P4C domain was located in the same region as the 20 kDa SidCLpn_P4C domain

of L. pneumophila. Both P4C domains can be used as LCV markers. This was shown with

GST-tagged proteins binding to LCVs in a cell homogenate. The two P4C domains show a

sequence identity of only 45% and the full-length protein of 40%. Circular dichroism

measurements revealed that the secondary structure of the two proteins is similar.

Moreover, isothermal titration calorimetric measurements indicated a 3.4 higher affinity of

SidCLlo towards PtdIns(4)P compared with SidCLpn.

In RAW 264.7 macrophages infected with L. longbeachae we showed that endogenous

SidCLlo as well as heterologously produced SidCLpn is translocated to the LCV in an Icm/Dot-dependent manner. The deletion of the sidCLlo gene led to a reduced recruitment

of calnexin to the LCV in infected Dictyostelium discoideum. This effect was

complemented by adding plasmid-encoded SidCLlo, SidCLpn or SdcALpn. The same

recruitment defect for a L. pneumophila strain lacking the sidCLpn and sdcALpn genes was

complemented by the production of SidCLlo and SidCLpn as published before. Therefore,

these effectors play a role for pathogen-host interactions by promoting the recruitment of

ER to the LCV. L. longbeachae or L. pneumophila wild-type strains outcompeted their

sidC deletion mutant in a competition assay in Acanthamoeba castellanii. However neither

of the deletion mutants were impaired in their growth in single strain replication

experiments. In summary despite of the small sequence identity and the higher binding

affinity to PtdIns(4)P of SidCLlo compared to SidCLpn both effector proteins seem to have

similar functions during an infection of Legionella.

For the characterization of L. longbeachae-containing vacuoles through proteomic

analysis, LCVs had to be isolated from infected D. discoideum or RAW 264.7

macrophages. Endogenous SidCLlo or heterologously produced SidCLpn were used as LCV

markers for the isolation. Pathogen vacuoles harbouring L. longbeachae were isolated by

immuno-affinity purification using antibodies specifically recognizing SidCLlo or SidCLpn.

Future inves

Prionerkrankungen gehören zu den neurodegenerativen Erkrankungen und können sowohl genetisch übertragen als auch erworben werden. Sie verlaufen bisher ausschließlich letal. Verursacht werden sie durch das PrPsc, die pathologische Isoform des physiologisch vorkommenden PrPc. Ein – teilweise noch kontroverser – Einfluss von Kupfer auf die Pathologie wurde mehrfach dargestellt. Bisherige Arbeiten haben diesen Einfluss jedoch insbesondere anhand der Bindung an die Oktarepeatregion untersucht; zunehmend wächst allerdings das Interesse an den Kupferbindungsstellen außerhalb dieser Region: unter anderem insbesondere am Histidin 95 (His95). Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig der Einfluss der Kupferbindung an der murinen Aminosäure Histidin 95 des Prionproteins (PrP) in vivo nach Infektion untersucht. Da die Erreger von Scrapie und CJD eine ähnlich Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur besitzen [51, 168], sind wahrscheinlich die Ergebnisse aus Tiermodellen - zumindest teilweise - auf das menschliche Prionprotein übertragbar. Zur Untersuchung wurden transgene Mäuse verwendet, die ein mutiertes PrP mit einem Aminosäure-Austausch von Histidin zu Glycin an der Position 95 des Prionproteins explizieren.

Zur Abgrenzung des Einflusses der Mutation nach Infektion wurde vorab eine Charakterisierung der nicht infizierten Mäuse durchgeführt: Die Mäuse nach Mutation (H95G-Mäuse) sowie das mutierte Prionprotein (H95G- PrP) wurden vor Infektion ausführlich untersucht und mit Wildtypkontrollen verglichen. Immunhistochemisch, histologisch und klinisch zeigte sich vor Infektion kein Unterschied zwischen H95G-Mäusen und Wildtypmäusen. Anschließend erfolgten diese Untersuchungen bei RML-infizierten H95G- und Wildtypmäusen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal anhand von homozygoten HG95+/+-Mäusen mit Prnp-/- Hintergrund und Prnp+/+-129/Sv- C57/Bl6-Kontrollmäusen ein signifikanter Einfluss der Kupferbindungsstelle am Histidin 95 auf die Pathologie und das Überleben nach Prioninfektion gezeigt werden. Die Ergebnisse wurden bei den Mäusen nach Infektion zweiter Passage geprüft. Hierdurch konnte eine stabile, signifikant verkürzte Inkubationszeit bei den H95G- Mäusen im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen werden.

Nach Infektion konnte weiterhin gezeigt werden, dass die H95G-Mäuse in fast allen beurteilten Hirnregionen reproduzierbar signifikant mehr plaqueartige PrPsc-Ablagerungen sowie reproduzierbar signifikant geringere spongiforme Veränderungen aufwiesen. Im Bereich des Kleinhirns zeigten sich signifikant deutlicher ausgeprägte, in den untersuchten Cortexbereichen signifikant geringer ausgeprägte synaptische PrPsc- Ablagerungen nach RML-Infektion, die teilweise reproduzierbar waren. Wahrscheinlich werden diese Ergebnisse beeinflusst durch den hier gezeigten veränderten Abbau des H95G- PrPsc, das im Gegensatz zum Wildtyp-PrPsc hauptsächlich über den a-Abbaumechanismus abgebaut wird, sowie den möglichen höheren Konzentrationen von H95G-PrPc.