Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/07

Gegenstand und Ziel: Seit 2011 gibt es eine veterinärmedizinische Strahlentherapieeinrichtung in der Universität München. Die Lebensqualität der Patienten und die Zufriedenheit der Patientenbesitzer wurden mittels Fragebogen evaluiert. Material und Methoden: Allen 91 Kleintierbesitzern, die seit April 2011 in der Medizinischen Kleintierklinik München vorstellig waren und sich für eine primäre oder adjuvante Strahlentherapie entschieden hatten, wurde ein Fragebogen zugesandt. Ergebnisse: 68 Besitzer (74,7%) sandten den Fragebogen zurück. Bei 60,3% (n = 41) kam es nach Einschätzungen der Besitzer zu einer Verbesserung der Lebensqualität ihrer Tiere nach Behandlung. 19,1% beschreiben eine Verschlechterung der Lebensqualität. 88,2% würden sich erneut für Strahlentherapie entscheiden. Schlussfolgerung: Die Verbesserung der Lebensqualität steht in Zusammenhang mit einer hohen Besitzerzufriedenheit von 83,8% (p = 0,003) und einer positiven Einstellung gegenüber Bestrahlung (p = 0,027). Klinische Relevanz: Trotz des intensiven Kosten- und Zeitaufwands in der Kleintier-Radioonkologie haben die Tierbesitzer eine positive Einstellung zur Strahlentherapie.

In den letzten Jahren hat die sonographische Untersuchung der Trächtigkeit bei der Farbmaus (Mus musculus f. domestica) mit dem Einsatz hochfrequenter und hochauflösender Ultraschallsysteme große Fortschritte gemacht. Ein routinemäßiger Einsatz blieb jedoch angesichts fehlender Standardisierung aus. Diese Methode der sonographischen Trächtigkeitsdiagnostik wurde bei der Vielzitzenmaus (Mastomys coucha), seit ihrer Einführung in die Versuchstierkunde, noch nicht untersucht und konnte von der Farbmaus aufgrund biologischer Unterschiede nicht übertragen werden.

Ziel dieser Arbeit war es, die transkutane sonographische Trächtigkeitsuntersuchung bei sechs unsedierten Vielzitzenmäusen im Alter von 18 Monaten mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 74,29 (± 8,1) g durchzuführen und einen umfassenden Überblick über den derzeitigen Stand der Technik der sonographischen Trächtigkeitsdiagnostik bei Farbmäusen darzustellen.

Die tägliche Untersuchung wurde mit dem mobilen MyLab™OneVET und einem 22 MHz Linearschallkopf (SL3116) der Firma ESAOTE Biomedica Deutschland GmbH im B-Mode, sowie im farbkodierten und gepulsten Dopplerverfahren (PW) durchgeführt. Insgesamt wurden im Verlauf 579-mal Ampullen und 304-mal Feten, bei einer Gesamtwurfgröße von 55 Jungen, ausgewertet.

Mit dem verwendeten Ultraschallsystem konnte die Trächtigkeit bei der Vielzitzenmaus, genauso wie bei den Farbmäusen, an Tag (E) 4,5 detektiert werden. Bei den Feten der Vielzitzenmaus hat sich die Bestimmung der Scheitel-Steiß-Länge (SSL), des Biparietalen (Kopf-) Durchmessers (BPD) und des Thorakoabdominalen Durchmessers (TAD) von Tag (E) 10,5 als praktikabel erwiesen und konnte zur Vorhersage des Trächtigkeitstages mit der Genauigkeit von ± 1 Tag herangezogen werden. PW- und Farb-Doppler wurden erfolgreich zur Darstellung des Umbilicalblutflusses und Bestimmung der fetalen Herzfrequenz eingesetzt.

Zusammenfassend erwies sich die transkutane und nicht-invasive sonographische Trächtigkeitsdiagnostik als eine zuverlässige, tierschonende und evaluierbare Methode zur Bestimmung der Trächtigkeit und Untersuchung der Feten bei der Vielzitzen- und Farbmaus. Auf Basis der aufgezeigten Ergebnisse kann diese Methode zukünftig in der Versuchstierkunde routinemäßig eingesetzt werden.

Das West-Nil-Virus (WNV) ist ein zur Familie der Flaviviren gehörendes Arbovirus, das weltweit zunehmende Verbreitung findet. Das natürliche Reservoir des Virus sind Vögel. Nach Übertragung durch Stechmücken kann es zu Infektionen von „Fehlwirten“, insbesondere Pferden und Menschen, kommen. Die meisten Infektionen verlaufen asymptomatisch oder mit der Entwicklung des West-Nil-Fiebers, einer relativ milden, Grippe-ähnlichen Erkrankung. In einigen Fällen, vor allem bei immungeschwächten und älteren Individuen, können aber auch lebensbedrohliche Infektionen mit schwerer neurologischer Symptomatik (z.B. Enzephalitiden) die Folge sein. WNV-Impfstoffe sind bisher nur für die Veterinärmedizin zugelassen und diese benötigen für einen effektiven Schutz häufige Auffrischungen. Außerdem gibt es keine effizienten Therapiemöglichkeiten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung weiterer wirksamer WNV-Impstoffe wünschenswert. Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene rekombinante Vakzinkandidaten auf Basis des Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) zu entwickeln, zu analysieren und bezüglich ihrer Eignung als Vektorvakzin zu bewerten. Das in seiner Replikationsfähigkeit extrem limitierte und hoch attenuierte MVA gehört bei der Entwicklung neuartiger rekombinanter Virusvakzine zu den viel versprechendsten Kandidaten. Potentielle WNV-Vektorvakzine beruhen überwiegend auf der Expression der beiden viralen Hüllproteine prM/M und E oder Teilen davon. Gerade das E-Protein stellt nach einer Infektion das Hauptzielantigen der adaptiven Immunantwort dar, indem es eine Vielzahl an immunogenen und protektiven Epitopen aufweist. Die fünf in dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Viren exprimierten zum Teil das E-Protein in unterschiedlicher Ausführung oder prM/M und E simultan. Damit wurden verschiedene Ansätze zur Induktion einer Immunantwort generiert und untersucht.

Alle rekombinanten MVA-Vektorviren waren bis auf die inserierten Zielsequenzen identisch und erwiesen sich als genetisch stabil. Die Replikationsdefizienz der Viren in den humanen und equinen Zielzellen konnte eindeutig nachgewiesen und somit ihre biologische Sicherheit

belegt werden. Für die Erzeugung hochtitriger Virusstocks und zur Impfstoffproduktion in größerem Umfang war es notwendig zu zeigen, dass sich die ins MVA-Genom inserierten Sequenzen nicht negativ auf das Vermehrungspotential der Viren in permissiven Zellen auswirkten. Es konnte belegt werden, dass alle Konstrukte dem Wildtypvirus ähnliche, und somit zur Produktion ausreichende, Wachstumsfähigkeiten besaßen. Als weitere wichtige Voraussetzung für die potentielle Verwendung der rekombinanten Viren als Kandidaten-Vakzine galt eine effiziente rekombinante Proteinexpression. Durch die Analyse der Proteinsynthese mittels Westernblot konnte nachgewiesen werden, dass diese bei allen Konstrukten stabil und produktiv verlief. Auch die Lokalisierung der rekombinanten E-Proteine durch Immunfluoreszenzfärbung und nachfolgender Konfokalmikroskopie infizierter Zellen brachte das erwartete Ergebnis.

Abschließend wurden zur ersten Einschätzung der Immunogenität der rekombinanten Viren WNV-spezifische Antikörper- und T-Zellantworten im Mausmodell untersucht. Alle Vektorviren waren in der Lage humorale und zelluläre Immunantworten zu induzieren. Hierbei erwies sich MVA-WNVESOL, was die, mittels Antigen-ELISA ermittelte, Antikörperantwort anbelangt als viel versprechendster Kandidat. Bezüglich der CD8+-T-Zellantwort konnte sich dies jedoch nicht bestätigen. Es ist anzumerken, dass weiterführende Untersuchungen der Testimpfstoffe in anderen präklinischen Modellen in Zukunft noch durchzuführen sein werden.

Die in dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Viren und gewonnenen Erkenntnisse belegen die Fähigkeit von MVA als viel versprechenden Vektorvakzin-Kandidaten gegen WNV. Die nachgewiesene Sicherheit und zugleich gute Vermehrungsfähigkeit in permissiven Zellen, die effiziente WNV-Antigen-Expression und die ersten positiven Daten zur I

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen die C-Komponente des Non-haemolytic Enterotoxin (Nhe)-Komplexes von Bacillus cereus sowie deren Einsatz zur Analyse der Rolle des NheC im Hinblick auf die Wirkungsweise von Nhe.

NheC wurde in Escherichia coli rekombinant exprimiert und mittels Immunaffinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Überprüfung durch SDS-PAGE und Quantifizierung mittels SYPRO® Ruby Protein Gel Färbung wurde das gereinigte Toxin als Immunogen eingesetzt. Nachfolgend konnten drei mAk vom IgG-Subtyp (mAk 2G8, 1E12, 2F10) und ein mAk vom IgM-Subtyp (mAk 3D6) gegen NheC hergestellt werden. Die Charakterisierung der mAk erfolgte mittels Enzymimmuntest (EIA), Western Immunblot und Immunfluoreszenzmikroskopie. Bei Verwendung eines indirekten EIAs erlaubten die mAk den sensitiven Nachweis von rNheC im unteren Nanogrammbereich (Nachweisgrenze 10 – 15 ng/ml). Untersuchungen zur Spezifität der mAk innerhalb des Nhe-Komplexes mittels indirekten EIAs und Western Immunblots zeigten, dass die mAk 2G8 und 1E12 substantielle Kreuzreaktionen mit der strukturverwandten NheB-Komponente aufweisen. Dies konnte durch Epitopanalysen und kompetitive Bindungstests noch bestätigt werden. Während die mAk 2G8, 1E12 und 3D6 mit allen überprüften B. cereus-Stämmen reagierten, weist das von dem mAk 2F10 erkannte Epitop eine stammspezifische Variabilität auf. In Zellkulturtests war keiner der vier mAk in der Lage die zytotoxische Aktivität des Nhe-Komplexes zu neutralisieren. Demgegenüber gelang es mit allen mAk mittels Immunfluoreszenz erstmals die direkte Bindung von NheC an die Zielzelle darzustellen.

Unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums gegen NheC als Fangantikörper und der vier mAk gegen NheC als Nachweisantikörper wurden hochempfindliche Sandwich-EIAs für den Nachweis von gereinigtem NheC entwickelt. In natürlichen B. cereus-Überständen konnten jedoch nur geringe Mengen (< 10 %) des theroretisch vorhandenen NheC nachgewiesen werden. Die auf diesen Ergebnissen basierende Hypothese, dass NheC in Lösung an NheB gebunden vorliegt, konnte zunächst in artifiziellen Systemen bestätigt werden. Mangels SDS-Stabilität der NheB-NheC-Komplexe, erfolgte der Nachweis mittels intermolekularem Cross-Linking und Dot Blot-Analysen. Durch Kombination des NheC-spezifischen mAk 3D6 als Fangantikörper und des HRP-gekoppelten mAk 1E11 gegen NheB als Nachweisantikörper konnte ein spezifischer NheC/B-Sandwich-EIA zum Nachweis von NheB-NheC-Komplexen in B. cereus-Kulturüberständen etabliert werden.

Zur Analyse der Funktion der NheB-NheC-Komplexe wurde zum einen die Komplexbildung mit der Zytotoxizität verglichen, und zum anderen per Durchflusszytometrie deren Zellbindung mittels NheB-Quantifizierung (durch mAk 1E11) bestimmt. Fazit ist, dass scheinbar sowohl eine definierte Menge an NheB-NheC-Komplexen, als auch ausreichend freies NheB vorhanden sein müssen, damit effiziente Zellbindung und Zytotoxizität von Nhe gewährleistet sind.