Margarita de Austria fue considerada, junto a Ana de Bretaña, Luisa de Saboya y Catalina de Aragón, una de las mujeres más inteligentes de la realeza europea. Hija del archiduque Maximiliano de Austria (luego Maximiliano I del Sacro Imperio Romano Germánico) y de María de Borgoña, duquesa de Borgoña. Hermana menor del archiduque Felipe el Hermoso, casado con Juana I de Castilla, hija de los Reyes Católicos, y de esta manera tía paterna de los hijos de éstos: Carlos V, y I de España, Fernando I de Habsburgo, Leonor de Austria, reina de Portugal y luego de Francia, Isabel de Austria, reina de Dinamarca, María de Austria, reina de Hungría y Catalina de Austria, reina de Portugal. Margarita le debió su nombre a la tercera esposa de Carlos el Temerario y madrastra de María de Borgoña, Margarita de York, hermana de Eduardo IV de Inglaterra.