Él mismo se costeó su primer microscopio antes de ganar, en 1876, una plaza de practicante en el Hospital Nuestra Señora de Gracia de Zaragoza. Un año después, tras fracasar en varias oposiciones, logró cátedras en distintas facultades de provincia hasta que logró la de Madrid en histología, donde fue investido doctor. Allí comenzó para Cajal una época de altibajos, con un 1878 terrible, marcado por la enfermedad de la tuberculosis, y un 1879 exitoso, con la obtención de la plaza de Director de Museos Anatómicos de Zaragoza y su boda con Silveria Fañanás García el 19 de julio, con quien tendría siete hijos.

Ganó la cátedra de Anatomía Descriptiva de la Facultad de Medicina de Valencia en 1883, donde pudo estudiar la epidemia de cólera que azotó la ciudad el año 1885. En 1887 se trasladó a Barcelona para ocupar la cátedra de histología creada en la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona. Fue en 1888, definido por el propio Cajal como su "año cumbre", cuando descubrió los mecanismos que gobiernan la morfología y los procesos conectivos de las células nerviosas de la materia gris del sistema nervioso cerebroespinal.

Su teoría fue aceptada en 1889 en el Congreso de la Sociedad Anatómica Alemana, celebrado en Berlín. Su esquema estructural del sistema nervioso como un aglomerado de unidades independientes y definidas pasó a conocerse con el nombre de «doctrina de la neurona», y en ella destaca la ley de la polarización dinámica, modelo capaz de explicar la transmisión unidireccional del impulso nervioso.

En 1892 ocupó la cátedra de Histología e Histoquímica Normal y Anatomía Patológica de la Universidad Central de Madrid. Logró que el gobierno creara en 1902 un moderno Laboratorio de Investigaciones Biológicas en el que trabajó hasta 1922, momento en el que pasa a prolongar su labor en el Instituto Cajal, en donde mantendría su labor científica hasta su muerte.