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#57 Voltage imaging: a “holy grail” of neuroscience
Pieribone + Chen の in vivo 膜電位イメージング論文を題材に、遺伝学的膜電位センサー(GEVI)、広視野+高速２光子顕微鏡、U-Netベースのノイズ除去手法について掘り下げました (4/30収録)
Show Notes (完全版)：
GEVIパート
黎明期のプローブ
ただし、黎明期プローブは膜上に移行しづらく使いにくいという問題があり、使いづらかった。
GEVI開発で気を付ける点は以下（St-Pierreによるレビューを参照）
2005年に岡村先生が報告したホヤ(Ci)由来の電位依存ホスファターゼ（VSP）の電位感受ドメイン（VSD）は膜移行性が良く、これを用いたプローブが2007年から出てきた。また、2011年にはロドプシンが電位依存的に蛍光を変化させるタンパク質として使えることが報告された。現在では、この２つの電位センシングモチーフが主に使われている。
1. Voltage sensitive phosphataseのVSDを使った系列
1-1: VSDの末端に２つの蛍光タンパク質をつけてFRETするタイプ
ただしkinetics遅め
1-2: VSDのC末に蛍光タンパク質を入れるタイプ（特にpHluorine改変体）
VSDのC末に入れるタイプは、FRETもArcLightもキネティクスが遅い。しかしArcLightについては未だにGEVIの中で一番大きい蛍光強度変化を示す。
1-3: VSDの細胞外ループにcpGFPを挿入するタイプ
予備知識：
2. ロドプシン系列
予備知識：
2-1: ロドプシンそのものの蛍光を見る
ただしロドプシン系は二光子では使えない。
2-2: ロドプシンのC末端に蛍光タンパク質/色素を融合し、ロドプシンとFRET
ロドプシンのC末端に蛍光たんぱく質をつけて励起。電位依存的な構造変化が起こって、蛍光たんぱく質がロドプシンに近づいた時にFRETが起こり、暗くなる。つまりロドプシンが電位センサーかつFRETアクセプターとして働く。ロドプシンより励起に必要なレーザー強度が少なくて済み（1/50~1/100程度）、ロドプシン単体のものほどではないがキネティクスが速い（ASAP系よりも速い）。
おまけ：
顕微鏡パート
Jerry ChenのCRACK。とそれを読んだNR回。
Elly Nedivi, Peter Soとの共著の仕事。抑制性シナプスのクラスタリングを見たもの。
Elly Nedivi, Peter Soとの共著の仕事。抑制性シナプスのクラスタリングを見たもの。
広域顕微鏡開発で使われたTemporal Multiplexing
単純な仕組みとはいえ、<10nsの時間解像度でシグナルを処理するFPGAの設計は結構トリッキーらしい(Kaspar談)。
2x
4x
Spatial MultiplexingはそれこそPeter Soが先駆け
GFPの蛍光が2~3nsなので8nsのtemporal delayではcross-talkないのでは...と言っていますが、これは光子数が1/eになる時間なので、e^3~=20から、ざっくり全蛍光の5~10%くらいは漏れ込んでもおかしくないことになります。
Denoisingパート
Self-supervisingの説明を簡略化のためにDeepCADを例に用いて行いましたが、DeepVIDではspatialなinterpolationも行われています。ターゲットにするフレームの10%(この値はハイパーパラメタサーチの結果empiricalに決めている)をblindにしておいて、L2の計算をこのblind pixelsのみに対して行うことで、spatialな情報も利用するようになると考えられます。Shot-noiseはtempora/spatialともに独立なノイズになりますが、signalはspatialにもlocal correlationが高いことが多いので、ノイズだけが主に消えることになると考えられます。
元になったアーキテクチャ・フレームワーク
RonnebergerらによるU-Netと3D-U-Net
U-Netを元にしたノイズ処理の元ネタ: Noise2Void
Editorial Notes:
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By NeuroRadio
4.7
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Pieribone + Chen の in vivo 膜電位イメージング論文を題材に、遺伝学的膜電位センサー(GEVI)、広視野+高速２光子顕微鏡、U-Netベースのノイズ除去手法について掘り下げました (4/30収録)
Show Notes (完全版)：
GEVIパート
黎明期のプローブ
ただし、黎明期プローブは膜上に移行しづらく使いにくいという問題があり、使いづらかった。
GEVI開発で気を付ける点は以下（St-Pierreによるレビューを参照）
2005年に岡村先生が報告したホヤ(Ci)由来の電位依存ホスファターゼ（VSP）の電位感受ドメイン（VSD）は膜移行性が良く、これを用いたプローブが2007年から出てきた。また、2011年にはロドプシンが電位依存的に蛍光を変化させるタンパク質として使えることが報告された。現在では、この２つの電位センシングモチーフが主に使われている。
1. Voltage sensitive phosphataseのVSDを使った系列
1-1: VSDの末端に２つの蛍光タンパク質をつけてFRETするタイプ
ただしkinetics遅め
1-2: VSDのC末に蛍光タンパク質を入れるタイプ（特にpHluorine改変体）
VSDのC末に入れるタイプは、FRETもArcLightもキネティクスが遅い。しかしArcLightについては未だにGEVIの中で一番大きい蛍光強度変化を示す。
1-3: VSDの細胞外ループにcpGFPを挿入するタイプ
予備知識：
2. ロドプシン系列
予備知識：
2-1: ロドプシンそのものの蛍光を見る
ただしロドプシン系は二光子では使えない。
2-2: ロドプシンのC末端に蛍光タンパク質/色素を融合し、ロドプシンとFRET
ロドプシンのC末端に蛍光たんぱく質をつけて励起。電位依存的な構造変化が起こって、蛍光たんぱく質がロドプシンに近づいた時にFRETが起こり、暗くなる。つまりロドプシンが電位センサーかつFRETアクセプターとして働く。ロドプシンより励起に必要なレーザー強度が少なくて済み（1/50~1/100程度）、ロドプシン単体のものほどではないがキネティクスが速い（ASAP系よりも速い）。
おまけ：
顕微鏡パート
Jerry ChenのCRACK。とそれを読んだNR回。
Elly Nedivi, Peter Soとの共著の仕事。抑制性シナプスのクラスタリングを見たもの。
Elly Nedivi, Peter Soとの共著の仕事。抑制性シナプスのクラスタリングを見たもの。
広域顕微鏡開発で使われたTemporal Multiplexing
単純な仕組みとはいえ、<10nsの時間解像度でシグナルを処理するFPGAの設計は結構トリッキーらしい(Kaspar談)。
2x
4x
Spatial MultiplexingはそれこそPeter Soが先駆け
GFPの蛍光が2~3nsなので8nsのtemporal delayではcross-talkないのでは...と言っていますが、これは光子数が1/eになる時間なので、e^3~=20から、ざっくり全蛍光の5~10%くらいは漏れ込んでもおかしくないことになります。
Denoisingパート
Self-supervisingの説明を簡略化のためにDeepCADを例に用いて行いましたが、DeepVIDではspatialなinterpolationも行われています。ターゲットにするフレームの10%(この値はハイパーパラメタサーチの結果empiricalに決めている)をblindにしておいて、L2の計算をこのblind pixelsのみに対して行うことで、spatialな情報も利用するようになると考えられます。Shot-noiseはtempora/spatialともに独立なノイズになりますが、signalはspatialにもlocal correlationが高いことが多いので、ノイズだけが主に消えることになると考えられます。
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